乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測方案

近日，蒙牛純牛奶被檢測出強致癌物——黃曲霉毒素M1，消息一出頓時又掀起一股食品安全隱患的討論。相比之前的三聚氰胺，黃曲霉素是否更難檢測？

現整理出全套的專業檢測方案，讓乳和乳制品中黃曲霉毒素M1無處躲藏。

1. 試用范圍

牛奶，奶粉，發酵乳，干酪，奶油等乳制品

2. 方法原理

黃曲霉毒素M1易溶于極性溶劑，因此均勻基質中的黃曲霉毒素M1可以通過甲醇/水震蕩分散提取，對于高脂肪/油含量的樣品基質加入正己烷予以脫脂。本方法采用免疫親和柱凈化，熒光檢測器測定乳制品中黃曲霉毒素M1。

3. 所需設備和耗材

黃曲霉毒素免疫親和柱：Welchrom? IAC (1ml，25支/盒；3ml，15支/盒)（上海月旭提供）；

高效液相裝置帶熒光檢測器；

均質機；

水平振蕩器；

SPE轉接頭及50ml大容量上樣器：Welchrom? SPE Adapter（上海月旭提供）；

分析天平（精度0.02 g)；

SPE裝置帶抽真空系統：Welchrom?  SPE Device（上海月旭提供）；

黃曲霉毒素M1標準品；

PBS 緩沖溶液：稱取1.16 g Na2HPO4，0.20 g KH2 PO4，8 g NaCl和0.2 g KCl 溶于900ml水中，用HCL或NaOH調節pH至7.4，然后定容至1000ml；

甲醇（色譜純）；

乙腈（色譜純）；

正己烷（分析純）。

4. 樣品前處理

牛奶樣品

1. 稱取25g(精確至0.01 g)混勻的樣品，置于50 mL具塞離心管中，水浴加熱至35℃～37 ℃，6000 r/min下離心10 min。收集全部上清液，待凈化；

2. 發酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)

3. 稱取25 g(精確至0.01 g)混勻的樣品，用0.5mol/L的NaOH溶液調節pH值至7.4，9500r/min下均質5 min，水浴加熱至35℃～37 ℃，6000 r/min下離心10 min。收集全部上清液，待凈化。

4. 乳粉和粉狀嬰幼兒配方乳制品

5. 稱取10 g(精確至0.01 g)樣品置于250 mL燒杯中，加入50 mL約50 ℃的水于乳粉中，玻璃棒攪拌均勻。溶解后冷卻至室溫，移入100 mL容量瓶中，水洗燒杯并轉移洗滌液，用PBS定容至刻度后裝入離心管6000轉/分鐘下離心15 min，混合上清液，取50mL上清液待凈化。

干酪

切取均質的樣品5g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇，9500 r/min下勻漿5 min，超聲提取30 min，6000r/min下離心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中，同時加入30 mL正己烷，振搖2 min，分層后，棄去正己烷層。重復用正己烷提取2次。提取液減壓濃縮至約2 mL，轉移濃縮液至離心管，燒瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL分2次洗滌并倒入50 mL離心管中，加PBS溶液稀釋至50 mL，6000r/min下離心5 min，上清液待凈化。

奶油

稱取5g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL燒杯中，用20 mL正己烷將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中，待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸發儀減壓濃縮至約5 mL，加PBS稀釋至約50mL，待凈化。

5. 免疫親和柱凈化（3cc）

1. 將IAC裝于固相萃取裝置上，接上大體積上樣器，10ml PBS溶液活化柱子，流速保持在2–3 ml/min，確保上樣前柱子保留少量（0.5ml）的PBS溶液，活化液不收集；

2. 將待凈化液加入免疫親和柱，流速不超過5 mL/min，不收集流出液；

3. 用約20ml去離子水淋洗柱子，流速不超過5 mL/min，抽真空1分鐘，不收集流出液；

4. 用1.5ml甲醇洗脫，流速控制在1d/s，收集洗脫液過膜后上機測試。

注：免疫親和柱從冰箱去除需升到室溫后使用

6. 色譜條件：

色譜柱：   Ultimate? XB-C18 250 mm x 4.6 mm，5μm（上海月旭提供）

預柱：     Ultimate? C18，5μm，ULT5BG18（上海月旭提供）

流動相：   水:甲醇:乙腈=11:4:5

柱溫：     35℃

檢測波長： 發射波長：365nm，激發波長：450nm

進樣量：   100μL