以生物素—親合素反應為基礎的酶免放大系統

生物素是維生素B復合物的水溶性成分之一，分子量244，可自卵黃提取或人工合成。生物素作為各種羧化酶的輔酶(又稱為輔酶R或維生素H)參與各種羧化反應。

親合素是從卵清中提取的一種67kD糖蛋白，生物素又叫維生素H，幾乎存在于所有細胞中，盡管含量較少。天然親合素是由4個亞單位組成的堿性糖蛋白，分子量為66 000～68000D，等電點(p1)為10．5。親合素活性單位的定義為：凡結合1ug生物素所需的親合素的量為親合素的一個活性單位。每毫克親合素最多能結合14／tg生物素，也就是說每毫克親合素所能獲得的最高的特異活性為14 U。鏈霉菌親生物素蛋白(streptavidin)的特性非常類似于親合素，可取代親合素用于涉及到生物素—親合素系統的酶聯免疫測定技術，而且非特異顯色較使用生物素更低。

生物素—親合素系統之所以能成為免疫測定技術中的重要工具，主要是因為其有下述幾個特點：①親合素對生物素的親和力極高，親和常數101‘／mol，為抗原抗體反應的百萬倍，具高度特異性和穩定性。②生物素分子小，結構簡單，極易與抗體、核酸、多糖及多種酶等生物大分子以共價鍵穩定結合，同時對結合物的原始生物活性無不良影響。③親合素性質極為穩定，每分子可結合4個生物素衍生物，其作為生物素化的分子之間的橋接物，起放大作用。同時，它又是糖蛋白，可直接與各種生物分子如IgG及茶堿、苯妥英、蛋白質等耦聯。

由生物素—親合素反應建立放大系統，一般有兩種方法，其一是用生物奉標記抗體，與固相抗原結合后，再加入親合素—酶結合物，從而使測定反應放大；其二是使用生物素—抗體、游離親合素和生物素—酶結合物三種試劑，試劑加入順序為生物素—抗體、親合素和生物素—酶。該方法之所以可行，在于親合素對生物素的四價結合能力，上述多步模式也可通過預先制成可溶的親合素—生物素化酶復合物而得到簡化，亦即所謂的ABC(avidin—biotin—complex)方法。但上述方法有時會見到較高的非特異背景顯色，這通常是由于帶陽電荷的親合素分子(等電點為10)的非特異相互作用的結果，因此，目前常用與親合素具同樣結合特性的從鏈霉親生物素蛋白(streptomyces avidinii)中提取的中性蛋白——鏈霉親合素(streptavidin)來代替親合素。普通的生物素—親合素放大系統可使常規的EIA方法的測定敏感性提高2—100倍。

Wilson等報道了一種生物素—鏈霉親合素的新型EIA測定放大系統，稱之為酶復合物放大(enzyme complex amplification，ECA)系統，其較常規的生物素—鏈霉親合素系統的放大作用要高1～2個梯度，與RIA相似。ECA放大系統的關鍵是ECA試劑，該試劑是鏈霉親合素、生物素—HRP和抗HRP-生物素的聚合體，可用來直接測定生物素化的抗原，或用于使用生物素化的抗體的ELISA中，亦可用于斑點免疫測定。ECA放大系統的優點是ECA試劑為預先制備，因此，操作中不增加EIA的測定步驟，此外，通過多層次ECA反應還可進一步增加測定的敏感性，缺點是對ECA試劑的制備要求較高；三種試劑之間的理想配比是成功地制備ECA試劑的關鍵。