體外診斷微流控技術在檢驗當中的應用

微流控研究起始于20世紀90年代，至今已經有20余年的發展歷史，其間經歷了基礎理論奠定、單元操作技術發展、小規模集成和大規模集成幾個歷史發展階段。至今，微流控技術發展臻于成熟，已經在多個領域得到認可并被廣為利用，其產業化趨勢亦是愈發明顯。2003年《福布斯》雜志把這項技術評為“影響人類未來15件最重要發明之一”；2004年，美國Business2.0雜志封面文章將微流控芯片列為“改變世界”的７種技術之一；2006年Nature雜志出版了一期微流控專輯，題名為“本世紀的技術”。微流控（microfluidics）的含義是微尺度下的流體控制，其研究對象是使用微米級通道操控納升級以下微量液體的系統。

鑒于芯片是實現微流體控制的主要平臺，因而微流控芯片（microfluidicchip）是微流控的主要研究內容。微流控芯片的制作主要依托于微機電系統（MEMS）加工工藝，具有在微米尺度級別實現微量流體操控的能力。

微流控芯片技術的特點來自于兩個方面：

一是微流體的特性：微尺度下流體的一系列特殊效應包括層流效應、表面張力及毛細效應、快速熱傳導效應和擴散效應等，這些效應有利于精確流體控制和實現快速反應；

二是微加工工藝帶來的結構復雜性：微加工工藝具有加工小尺寸、高密度微結構的能力，便于實現各種操作單元的靈活組合與規模集成。因此，樣品前處理、分離與分析、檢測等實驗流程得以在同一芯片上集成化和并行化，從而達到微型化、自動化、低消耗和高效率的目的。微流控芯片作為當代極為重要的新型科學技術平臺，非常符合國家層面產業轉型規劃。目前，微流控芯片研究的主流已從平臺構建和方法發展轉為不同領域的廣泛應用，并從應用需求中尋求科學問題，進而帶動產業化發展。

一、微流控體外診斷技術

體外診斷是指對人體的體液和組織等進行檢測而獲得臨床診斷信息。目前，承擔體外診斷的單位主要是醫院的檢驗科和第三方檢驗機構。體外診斷是典型的流體操控過程，追求操作便利性和分析結果準確性，因而微流控芯片是實現體外診斷的有利技術平臺，這表現在以下幾個方面：

（１）應用場景拓展：傳統的檢驗設備多為大型儀器，雖然在測試通量和穩定性上具有優勢，但其使用局限于專業實驗室。微流控芯片系統體積小巧、操作簡單，完全可以在門急診、基層醫療單位甚至床邊進行檢測，這極大地拓展了體外診斷的應用空間；

（２）分析效率的提高：集成化和并行化設計的微流控芯片系統，有能力在短時間內提供更為豐富的診斷信息，因而顯著提升了分析效率；

（３）測試成本的下降：微流控芯片使用微小反應體積，有利于減小試劑樣品消耗，從而降低測試成本。概括來講，微流控體外診斷技術的優勢可以歸結為多、快、好、省四個字，這種分析技術無疑是對現有體外診斷技術的巨大提升。

二、微流控體外診斷技術的應用

當前，傳統的體外診斷技術已經極為成熟。微流控體外診斷產品若要進入體外診斷市場，勢必要展示出高人一籌的能力。相比較傳統的宏觀檢驗設備，微流控產品最大的市場拓展潛力在于：

（１）針對傳統產品無法適用的應用環境開發產品；

（２）發展性能指標和操作便利性具有明顯優勢的顛覆性新產品。一個成功的微流控體外診斷產品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和測試成本等幾個方面達到平衡。以下，我們就幾個主要的臨床檢驗應用領域介紹一些代表性的微流控診斷技術。

（一）分子診斷

分子診斷是新興的檢驗醫學領域。隨著熒光定量ＰＣＲ的推廣，基因檢測技術在臨床醫學中得到了廣泛應用。盡管如此，現有核酸分析平臺的一些不足之處還是限制了分子診斷技術的推廣，諸如：

（１）場地要求嚴格，試劑準備、核酸提取和擴增需要分別在獨立房間內進行，極大限制了該技術在有限醫療資源條件下的開展；

（２）采用離線式分析，操作復雜、分析周期較長，不利于應對突發性事件；（３）現有的熒光定量ＰＣＲ方法多是針對單一指標檢測設計，對于多重基因檢測無論是操作繁瑣程度還是測試成本均是難以接受的。分子診斷是微流控芯片技術最具有代表性的應用領域。對于分子診斷應用，微流控芯片最大的貢獻在于該技術有潛力將核酸提取、擴增和檢測集成于同一裝置，因而可擺脫繁瑣操作以及對專業實驗室的依賴。此外，由于反應過程處于封閉的環境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片還需要具有一定的分析通量以滿足臨床實際需求。已經商業化的微流控分子診斷產品基本都是針對病原微生物檢測應用，其價值在于：

（１）實現現場快速檢測；

（２）解決難于培養鑒定病原（如結核桿菌、病毒、支原體等）鑒定問題。具有代表性的微流控分子診斷產品包括GemeXpert系統是一種整合全自動樣品制備的模塊化實時定量PCR儀，該系統可自動完成樣品裂解、核酸純化濃縮、定量PCR擴增檢測，提供快速、準確的測試結果。同時，該系統采用了模塊化設計，可依據通量需求選配1～80個可獨立運行的微流控分析模塊，且每個模塊可以同時檢測1～4個指標，因而具有較大的通量和靈活性。與GemeXpert系統類似，ｉｏ系統也可以自動完成樣品前處理、擴增檢測，從樣品加入到結果檢出所需的時間僅為30min。略有不同的是，io系統利用不同的電化學標簽標記的ＤＮＡ探針可在單張芯片內同時檢測最多24個指標，更為輕便且無需光學校準。目前都是全集成多重PCR檢測系統，所采用的微流控芯片均集成有細胞裂解、核酸提取純化、PCR和產物檢測功能。二者不同之處在于，前者采用兩步法多元巢式PCR擴增并結合熔解曲線進行產物分析，后者利用雜交芯片檢測多元PCR擴增產物，二者的單芯片檢測指標數高達24，但都不具備定量能力。作者課題組最近發展了一種串聯液滴陣列微流控芯片核酸分析系統，其設計理念是平衡集成、通量、成本及便攜性等關鍵因素。系統所用微流控芯片上設計有多組以狹縫通道連通的串聯微池，全部分析試劑均以油包水形式預存儲于其中。通過磁鐵陣列驅動磁珠在串聯液滴中穿行，依次完成細胞裂解、核酸的結合、洗滌、洗脫和擴增，從而實現了平行化的全集成核酸分析。該系統極為緊湊，適合于現場快速檢測及醫院門急診場景下的“隨到隨檢、快速響應”需求。

（二）免疫檢測免疫檢測是臨床檢驗極為重要的領域。

目前，臨床免疫檢測的主流技術是化學發光和免疫比濁法，具有靈敏度高和檢測線性范圍寬的優勢。這些檢測方法一般使用大型儀器，分析通量較高。由于購置成本和儀器體積因素，這類設備僅適合于大型實驗室使用。用于快速免疫檢測的主流技術是基于試紙條的膠體金法，雖然使用方便，但在靈敏度和線性范圍方面受限。因此，臨床檢驗工作需要一種兼具操作便利性和定量準確性的免疫檢測平臺，這對于急診以及基層醫療單位的免疫檢測尤其重要。已經見諸報道的微流控免疫產品多是針對心臟病和急性感染這些迫切需要快檢的項目。如華邁興微的Ｍ２微型化學發光分析儀，使用磁微粒免疫化學發光技術，在芯片上集成了血液過濾、免疫親和、磁珠洗滌、酶促發光反應和信號檢測等步驟，整個分析過程10～15min可完成。儀器使用自動識別密閉芯片卡，可避免交叉污染，減少人為失誤。由于操作簡便，非專業人員亦可完成。Ｗａｋｏ診斷公司的μＴＡＳＷａｋｏｉ３０免疫分析儀使用等速電泳方法，所用芯片集成了試樣加載、混合、樣品在線富集和檢測等步驟。該儀器可對每份樣本進行６種分析物的檢測，并在９min內即可獲得檢測結果。深圳微點公司的ｍＬａｂｓ?熒光免疫檢測平臺由定量熒光免疫檢測儀和配套的一次性微流控檢測卡組成。該系統采用毛細管力作為流體驅動力，因而無需外部流體驅動裝置，每張芯片進行一個或多個指標檢測，檢測時間僅需４～８min。作者課題組發展了一種微流控芯片免疫化學發光分析系統，該系統采用具有平行串聯微池結構的微流控芯片，結合液滴和磁微粒操作可在芯片上完成免疫化學發光分析的全部流程。借助平行化芯片設計和檢測器的快速掃描，可以在同一芯片上實現多個感染標志物聯合檢測。

（三）病原微生物檢測病原微生物檢測

主要包括病原鑒定和藥物敏感性判定兩個方面。目前，臨床微生物檢測面臨的最大問題就是檢測周期過長。對于感染性疾病，臨床醫師做出經驗或循證診療方案選擇的時間窗口通常很窄（甚至＜１０min）。只有盡可能縮短分析測試時間，才能更加有效地發揮這些檢測的臨床指導作用。然而，目前的病原微生物鑒定和藥物敏感性判定的典型周期是２～３ｄ，這顯然難以滿足臨床需求。病原檢測技術的限制所帶來的結果是，一方面經驗性診斷的準確性難以保證，另一方面抗生素濫用引發了嚴重的耐藥問題。微流控技術對于病原微生物鑒定的解決方案多是采用核酸檢測策略，這在前面部分已經敘述。鑒于抗生素敏感性測試（ＡＳＴ）的實質是判定病原微生物在藥物暴露條件下的增殖情況，對應的微流控分析策略是：

（１）通過微縮培養器體積，實現檢測信號的相對富集；

（２）使用更為精準的病原定量技術。這兩種策略均可以通過縮短病原培養時間實現快速的藥物敏感性判定。目前尚無成型的微流控藥物敏感性檢測產品，但相關研究仍在不斷探索。Ｋａｕｓｈｉｋ等利用微流控液滴技術，將細菌和抗生素混合后分散于含有熒光底物的皮升級體積液滴中，依據熒光顯色結果判定細菌存活。得益于微體積液滴對熒光反應產物的相對濃縮效應，該方法僅需１ｈ即可判定大腸桿菌對于抗生素的敏感性。Ｓｃｈｏｅｐｐ等報道了基于液滴數字ＰＣＲ的ＡＳＴ。相比較定量ＰＣＲ，ｄＰＣＲ具有更高的準確性和更寬的檢測范圍，因而可以更加靈敏地反映出細菌計數的變化。研究結果顯示，應用ｄＰＣＲ方法可以在抗生素處理后１５min顯示出敏感菌和耐藥菌的數量差異。由此可見，應用ｄＰＣＲ可以顯著縮短ＡＳＴ分析所需的抗生素暴露時間。基于這些具有借鑒意義的工作，作者課題組發展了一種基于液滴陣列微流控芯片的數字化抗生素敏感性測試方法，其設計理念是借助于數字化分析的精準定量能力縮短細菌抗生素暴露時間。細菌懸液與抗生素孵育后引入微流控芯片完成液滴發生和捕獲，生成高密度微液滴陣列。通過對液滴陣列進行熒光掃描成像，檢測每個液滴中的熒光信號并以此計算出陽性微液滴比例（ｐ）。根據ｐ值用泊松分布算法推算出細菌密度即可反映抗生素對于細菌的增殖抑制效應。應用該方法，僅需30min抗生素暴露時間即可判定大腸埃希菌的抗生素敏感性測試結果。

三、微流控體外診斷技術的機遇與挑戰

目前，我國正處于巨大的社會變革過程當中，一方面國力的增強和科技的進步促進了新技術的發展和推廣，另一方面新形勢對于體外診斷行業提出了新的要求。體外診斷作為一個高附加值行業，將會在未來相當長的階段中快速發展。隨著醫療改革的推進，三級醫療體系將逐漸完善，隨之而來的是醫療資源由集中模式轉變變為分散模式，第三方檢驗機構的興起，以及共享經濟模式的沖擊，勢必會對體外診斷技術提出更高的要求。在這種形勢下，微流控技術將會對體外診斷行業的發展提供一個有利的契機。雖然微流控體外診斷技術得到了學術界和產業界的普遍認可，現實中的微流控體外診斷產業進程仍然是步履艱難。相比較研究領域取得的巨大進展，微流控體外診斷技術的產業化進程要緩慢得多。從技術角度來看，微流控體外診斷產品開發涉及多個學科領域，包括醫學、生物、化學和工程等。任何一個企業，想要建立這樣一個規模的研發隊伍都絕非易事。以微流控芯片為載體的微分析體系并非只是對應的宏觀體系的簡單微縮，其在很多方面都有別于傳統產品。例如，微分析體系的表面效應特征非常突出，這是由于其比表面積的顯著增加。相應地，各種表面效應變得非常顯著，無論是表面張力、表面吸附還是熱傳導效應都與宏觀體系有很大差別。因此，與表面效應相關的各種因素，包括材料性質、通道尺寸、試劑成分、表面處理工藝都會對分析功能造成顯著影響。還有，微流控芯片制造涉及的ＭＥＭＳ技術，也并非傳統的加工工藝。由于傳統體外診斷制造業對于上述問題了解有限，導至了微流控產品的研發難度遠遠高于傳統體外診斷產品。從產業環境角度看，研究、生產和應用單位的脫節，高端加工技術的欠缺也增加了微流控產品開發的難度。從臨床應用角度看，現階段的微流控產品僅在某一些臨床應用中的檢測性能或效率可以達到甚至超越傳統技術方法平臺，但尚未形成全面超越的優勢，特別是微流控技術存在的一些局限，包括難以快速處理大體積中的低豐度樣品、高比表面積帶來的樣品吸附損失加劇等問題，也給其臨床應用造成不利影響。從質量控制體系角度看，作為新入場者的微流控診斷產品尚未建立或健全與之相適應的質量控制體系，在一定程度上也限制了其在包括基層醫療單位及家庭等更廣泛場合的推廣應用。令人欣慰地是，目前已經有部分微流控診斷產品開始步入了臨床應用，其相比于傳統平臺方法的一些優勢已初露端倪。但是，總體上看，微流控技術仍未能如預期那樣對傳統體外診斷產品帶來巨大沖擊。對于上述問題，我們認為微流控體外診斷技術產業化過程中以下幾個方面值得關注：首先是明確的市場定位，相比較傳統技術，微流控產品必須在某個應用領域或應用場景下具有突出的優勢；其次是前期研究基礎，由于微流控產品研發技術門檻較高，缺少扎實的研究基礎會增加開發進程的不確定性；再者就是盡量規避技術制約，由于各種條件限制，某些類型芯片可能在一定階段內不具備量產可行性。因此，我們對于微流控診斷產品開發的建議是：（１）選擇恰當的應用對象；（２）整合研發資源，研發團隊需要包含技術、工程和應用專家；（３）創造性的產學研合作模式。

四、結語

總體看來，微流控體外診斷技術的發展前途是光明的，道路是曲折的。無論如何，我們堅信微流控技術是新形勢下應對臨床檢驗醫學挑戰的有力工具，該技術勢必會對臨床檢驗能力的提升起到巨大的推動作用。