五、蛋白質的鹽析法
向蛋白質溶液中加入不同濃度的中性鹽，可以把不同的蛋白質分別沉淀出來。這種方法稱為蛋白質的鹽析。
利用蛋白質的鹽析法，可以得到我們所需的不同的免疫球蛋白。最常用的中性鹽包括，硅酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉等，其中以硫酸銨最為常用：
（一）、優點
1、在水中溶解度大，其飽和溶液含有大量鹽；
2、在水中的溶解度受溫度的影響很小；
3、一般不會引起蛋白變性。
（二）、缺點
提取的純度較差，所以只能用它作為粗提。
飽和硫酸銨溶液配法：
取760g～800g硫酸銨，放人70～80℃蒸餾水1000mL中，攪拌約20min，室溫靜置過液，硫酸銨結晶析出，即上清為飽和硫酸銨，再用NH40H調pH為7.0。
六、實驗內容
（一）稀釋血清
向血清中加入生理鹽水，做1︰1稀釋，主要目的，以防蛋白質溶液濃度過稠，引起其它蛋白質共沉，或局部蛋白質變性。
（二）用50%飽和度硫酸銨提取免疫球蛋白
將用生理鹽水按l︰1稀釋的動物血清置于三角燒瓶或燒杯中，在電磁攪拌器不斷攪拌下，逐滴加入與稀釋的蛋白液等量的飽和硫酸銨（血清1體積+生理水1體積+飽和硫酸銨2體積），攪拌的目的是為了防止局部硫酸銨濃度過高。攪拌后，室溫放置0.5～1h，或置4℃冰箱過夜，次日取出，以每分鐘4000轉離心30min（離心管周圍加冰塊或冰水），離心后棄上清（內含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。
硫酸銨溶液的飽和度是指在整個溶液中所占的百分比，與原蛋白液的濃度無關。
分子量大的蛋白質先沉淀，分子量小的蛋白質后沉淀，球蛋白的分子量20～30萬，而白蛋白的分子量只有69000，所以50%飽和度硫酸銨沉淀的是球蛋白，而白蛋白則留在上清液中。
（三）用33%飽和度硫酸銨提取血清中的γ球蛋白
當血清中飽和硫酸銨為50%飽和度時，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及極少量的白蛋白，當硫酸銨飽和度由50%減少到33～35%時，沉淀蛋白質中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相應逐漸減少，而γ球蛋白的純度逐漸提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。
用生理鹽水或 PBS將沉淀物攪拌溶解，其溶成原血清體積（1體積），向其中滴加飽和硫酸銨1/2體積。使硫酸銨飽和度為33%，邊滴邊攪拌，冰相中靜置O.5～1h，同上法離心，棄上清（a、β球蛋白），按上述步驟再重復二次，即33%飽和度硫酸銨反復提取三次，即可獲得
表1 從不同種動物血清中提取y球蛋白所用硫酸銨濃度和沉淀次數
血清來源
硫酸銨飽和度%和沉淀系數
血清來源
硫酸銨飽和度%和沉淀次數
家兔
綿羊
馬
山羊
牛
35×3
35×3
30×3
30×1 45×1
35×3
豬
雞
豚鼠
小白鼠
大白鼠
35×3
35×3
35×1 40×2
35×1 40×2
35×3
較純的γ球蛋白。一般來說，蛋白質溶液中的飽和硫酸銨濃度達到即33%時，γ-球蛋白被沉淀出來。但從不同動物的血清中分離γ球蛋白的最適飽和硫酸銨濃度和沉淀次數不完全相同。從各種動物血清中制備γ球蛋白所需的硫酸銨濃度和次數如下表。
（四）脫 鹽
免疫血清經硫酸銨提取后，其蛋白液中含有大量硫酸銨，必須除去，常用的方法有透析法和葡聚糖凝膠過濾法兩種。
1、透析袋除鹽法：半透膜具有使小分子或離子透過而蛋白質分子不能通過的特性。一般先用蒸餾水沖洗透析袋（也可用玻璃紙），用橡皮筋或細繩結扎透析袋的一端，檢查無破口后，加入擬脫鹽的蛋白液（33%飽和度的硫酸銨沉淀后的蛋白，用原血清量10～20%的生理鹽水溶解），裝完蛋白液，排出空氣，留一定空隙。扎好另一端。開始先用蒸餾水透析過夜，水量至少是蛋白液的50 倍，然后移至PBS或生理鹽水中，置4℃透析2～3d，每天換液二次以上，用氯化鋇溶液檢查SO42+，用奈氏（Nessler′s）試劑檢查NH+。
2、 SepadexG25過柱除鹽法：SepnadexGl0、15、25或50系細孔凝膠，可排阻所有蛋白質，而鹽類可自由進入，用此法可方便地將蛋白質和鹽分成兩個組分，常用G25或G50除鹽，使用的層析柱一般是2.5×25～50cm。凝膠的預處理、裝柱、平衡等與一般方法相同。
七、實驗步驟
八、注意事項
1、操作過程可以在室溫下進行，但溫度不宜太高，應盡量在較低溫度下進行，避免蛋白質活性喪失；
2、鹽析前，血清要用等量的PBS（0.01mol/L pH7.2）或生理鹽水稀釋，可以減少其他蛋白質與γ-球蛋白的共沉現象。蛋白質含量低于3%時可不稀釋；
3、混有鐵離子的硫酸銨須除去鐵離子。方法是用15N NH40H凋pH至9，加熱，產生棕紅色沉淀，用濾紙濾除，再加稀硫酸（硫酸:水=1:2），調pH7.0～7.2穩定24h后再用；
4、飽和硫酸銨應逐滴加入，邊加邊攪，以減少局部高濃度硫酸銨所引起的共沉現象，攪拌速度不宜過快，以免產生泡沫；
5、蛋白質被沉淀后應在冰箱放置過夜，使能結成較大的沉淀塊而易于分離。分離（離心沉淀或過濾）沉淀物應在4℃條件下進行，以免蛋白質變性；
6、以上程序（50%飽和度1 次，33%2～3次）可獲得較純的γ球蛋白，有時尚有混少量的β球蛋白；
7、如提純材料為血漿，則先應除去纖維蛋白質，方法是：先加入2.0%飽和度的硫酸銨，沉淀纖維蛋白質，離心沉淀除去之，然后繼續加硫酸銨至50%飽和度，以沉淀球蛋白。
九、結果判斷與討論
抗原免疫動物后獲得的抗血清，效價可用上述相應試驗判斷；其特異性則可通過雙擴、免疫電泳或交叉凝集試驗進行考察。此外，抗血清的外觀應該為澄清、力求無溶血、無血液有型成分殘留和無細菌等微生物污染。
附：實驗動物的抓取、固定和注射方法
在生物制品學實驗中，常常用到實驗動物。進行實驗時，首先要限制動物的活動，使動物保持安靜狀態，才便于抓取和固定。固定動物的方法依實驗內容和動物種類而定。在抓取、固定動物前，應對實驗動物的習性有所了解。在抓取過程中，既要膽大心細，又要準確敏捷，不能粗暴，確實達到抓住和固定的目的。在生物制品學實驗中，為了制備抗體或觀察藥物對機體免疫功能的影響，需要將抗原或藥物注入動物體內。注射的途徑和方法多種多樣，應根據實驗目的，實驗動物種類和藥物劑型，抗原的性質來確定。
1、皮下注射法（subcutaneous injection，sc，以豚鼠為例）
1）助手用左手夾持動物肩部，并用大拇指鉤住下頜部，將動物提起，右手在下方將動物托起，手心向上，用食指、中指及無名指夾住后腿；
2）用碘酒和酒精棉球消毒豚鼠蹊部。注射者將皮膚提起，以預先準備好的注射器針頭（內裝無菌生理鹽水）刺入皺褶底部，注射0.5mL。注入時阻力不大而放下皮膚后，皮下呈擴散狀隆起者為注射正確。
2、皮內注射法（mtracutaneous injection，ic，以豚鼠為例）
1）助手按上法將豚鼠抓緊；
2）實驗者在其腹部任選約2cm2的面積剪毛，消毒皮膚；
3）將5號針頭連接在1mL的注射器上，吸取無菌生鹽水，針空向上平刺人皮內，注入 0.1~0.2mL，如準確注射在皮內，則注射部位形成堅實的水泡。
3、腹腔注射（intraperitoneal injection，ip，以小自鼠和家兔為例）
小白鼠：
1）用右手拖鼠尾，使其爬行于較粗糙之臺面上，再突然用左手拇、食指抓緊小白鼠頸項及其兩耳，翻轉后，用左手無名指及小指夾住鼠尾及后肢；
2）消毒腹壁，以預先準備的材料（無菌生理鹽水）注入腹腔0.3mL。
注意：注射時應將小白鼠的頭部向下，以避免針頭刺人內臟。針斜刺入皮膚后，轉直，再向下直刺少許即可進入腹腔，其目的是使兩個針眼不在一條直線上，可避免拔出針頭時注射材料流出污染皮膚及造成注射劑量不足，在注射傳染材料時，應特別注意。另外，進針部位不宜太近上腹部或進針過深，以免刺破內臟。
家兔：
1）將家兔四肢固定在解剖臺上腹部朝上；
2）在下腹部略靠外側（腹部下約1/3處，避開肝和膀胱），消毒該處皮膚，將針頭垂直刺入腹腔，將針筒略為回抽，如無血液或尿液，即可進行注射。注入1mL無菌生理鹽水。
4、肌肉注射（intramuscuLar injection，im，以小白鼠為例）
此法用得較少，常用于給動物注射混懸于油或其他溶劑的藥物時。肌肉注射部位，應選擇豐滿且無大血管通過的肌肉，一般采用臀部．亦常取大腿內（外）側，頸椎或腰椎旁的肌肉進行注射。注射時，將注射部位的被毛剪去（小動物可不剪毛）。注射器連61/2號針頭，由皮膚表面垂直刺人肌肉，略回抽如無回血，即可注射。給小白鼠作肌肉注射時，用左手抓住鼠兩耳及頭部皮膚，右手取連有51/2號針頭的注射器，將針頭刺入大腿外側肌肉，注入0.2mL無菌生理鹽水。
5、靜脈注射（intravenousinjection，iv，以家兔和小白鼠為例）
家兔：
1）捉兔時，輕開籠門，勿讓兔受驚。將手伸入籠內，于兔頭前面阻攔其跑動，當兔匍匐不動時，右手抓住頸部皮膚將兔提起，左手隨之托住其臀部，不正確的抓取方法：①易傷兩腎。②易造成皮下出血。③可傷兩耳。正確的抓取方法：抓住頸后皮膚，并用手托起。
2）將家兔固定于特制木箱中或由助手按在桌上（一手輕輕按其頸部，一手輕扶耳根，使耳向前）。剪去或拔去兔耳緣部被毛；
3）用棉球或少許紗布沾取45～50℃的溫水于耳翼邊緣的血管上，或用手指輕彈并輕揉兔耳，使靜脈充血，助手以一手將耳根固定；
4）注射者以左手持該耳，右手將預先準備的材料（無菌生理鹽水）出血管注入，針頭刺入時與靜脈幾乎相平行，注入0.5mL。如注射正確，則針下阻力較小，亦可見血管變色；如阻力較大或皮下隆起即停止注射，重新刺入血管，或另選部位；注入液體時應將針頭與耳同時固定，以免針頭退出血管；
5）注射完畢用消毒干棉球壓住注射部位，然后拔出針頭，再壓片刻以防出血。
小白鼠：
1）將小白鼠置小試管簍中，鼠尾自網眼中露出；
2）將鼠尾浸于盛45~50℃溫水的試管中1～2min或用棉花沾溫水揉擦尾部使尾靜脈充血，可見三根暗紅色的尾靜脈;
3）選最明顯的一條尾靜脈，用左手三指捏住鼠尾，在距尾尖 2～3cm（此處皮薄脈淺，易刺入）進針，針頭與尾靜脈幾乎相平行，注入無菌生理鹽水0.3mL。其余操作同兔耳靜脈注射。
6、胃內注入法（灌胃法，ingestion，ig，以小白鼠為例）
1）用左于拇指及食指抓住小鼠兩耳及頭部皮膚，另三指抓其背部皮膚，翻轉，使其腹部朝上，頭部向上保持一定的傾斜度;
2）右手持連有灌胃針頭的注射器，將針頭對準正中線插人口腔，沿咽后壁中線慢慢向后，向下插入。亦可沿鼠右側嘴角插入，經食道進入胃內。若遇阻力則后退稍許再慢慢進針，插入2～2.5cm即可到達食道下端，注入0.5mL無菌生理鹽水。注入時如通暢，表明針頭已插入食道；如不通暢，動物有嘔吐動作并掙扎，則表明針頭未插入食道，應立即拔出，按上法重新操作。
灌胃法的要點在于：小鼠要固定好，頭和頸部保持極平，進針方向正確，—定要沿正中線或右口角進針，再順著食道慢慢插入，不可硬往里插，否則注入肺內，造成死亡。
注射器的準備與消毒
1、選擇大小適宜而注射針筒與筒芯號碼一致的注射器，并先吸入清水，試其是否漏水，漏水的注射器不能使用，因其注射量不準確，且易引起污染及傳染；
2、視選擇的動物及注射途徑之不同而選用不同長短大小的針頭，并先試驗是否通氣或漏水；
3、消毒時將筒芯從筒中拔出，用脫脂紗布以相同的方向先包針筒后包筒芯，置煮沸消毒器中，選好針頭，包好紗布置煮沸消毒器另一端，同時放入鑷子一把，加入自來水，以覆蓋注射器為度，煮沸10min（從水沸之時算起）；
4、消毒完畢后，用鑷子取出注射器，置筒芯于針筒中，針頭牢固地裝在針筒的針嘴上，使其斜面與針筒上的刻度方向一致，吸入注射材料，準備注射；
5、若使用一次性注射器，則不必消毒，買來即可使用。
注意事項
1、吸入注射材料后，應將注射器內的空氣排盡，若注射材料具有傳染性，則排氣時應以酒精棉球包住針頭，以免傳染材料流出；
2、注射完畢后，如注射材料具有傳染性，應以消毒器中的水抽吸幾次，然后取下針頭，抽出筒芯放入消毒器中與抽吸洗過的水一并煮沸消毒，煮畢后洗凈注射器及針頭置干燥箱中烘干后，分別收藏備用。
