（一）材料與方法
1. 生物素標記特異性抗體的制備
基存免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖在，因而可用能與糖基結合的Biotin-hydrazide作生物素標記。
（1） 將純化的抗體（IgM或IgG， 0.1~1.0ml）在標記緩沖液（0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl）中4℃透析過夜。
（2）吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度為10mMol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
（3）將氧化的抗體過PBS平衡的Sephadex G25 PD-10預裝柱，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。
（4）向抗體管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至終濃度5mMol/L，置混搖器上室溫孵育1h。
（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25預裝柱，將生物素標記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存-20℃。
2. 生物素標記DNA片段的制備
作為將與抗體偶聯的報告DNA片段，應確保在待測抗原來源的機體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報告DNA去檢測人源的標本。
DNA片段大小為300~500bp，生物素標記可采用PCR方法，根據報告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個引物的5’端堿基上帶有生物素標記。在0.5mlPCR管中按表將下列試劑混合。
表PCR系統組成
試 劑 添加量 終濃度
10×PCR 緩沖液 10.0ul 1×
2.5mMol/L 4dNTP混合物 8.0ul 0.2mMol/L
50uMol/L生物素標記的上游引物 1.0ul 0.5uMol/l
50uMol/L生物素標記的下游引物 1.0ul 0.5uMol/l
15mMol/L模板 DNA 1.0ul 1.0ug
Taq DNA聚合酶1.0ul 5U
加水至 100uL
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min;
40個循環。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL無水乙醇，置-70℃
30min。離心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。 將沉淀DNA干燥后溶于TE緩沖液中，保存在-20℃。
3. 制備抗體-親和素-DNA復合物 子濃度的生物素標記的DNA片段，繼續孵育30min，最后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結合部位飽和。最后過凝膠過濾柱將復合物與未結合的單體分開，加入BSA達 1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。