（一）材料與方法
1. 生物素標記特異性抗體的制備
免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結合的Biotin-hydrazide作生物素標記。
（1） 將純化的抗體（IgM或IgG， 0.1~1.0ml）在標記緩沖液（0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl）中4℃透析過夜。
（2）吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度為10mMol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
（3）將氧化的抗體過PBS平衡的Sephadex G25 PD-10預裝柱，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。
（4）向抗體管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至終濃度5mMol/L，置混搖器上室溫孵育1h。
（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25預裝柱，將生物素標記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存-20℃。
2. 生物素標記DNA片段的制備
作為將與抗體偶聯的報告DNA片段，應確保在待測抗原來源的機體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報告DNA去檢測人源的標本。
DNA片段大小為300~500bp，生物素標記可采用PCR方法，根據報告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個引物的5’端堿基上帶有生物素標記。在0.5mlPCR管中按表將下列試劑混合。
95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min; 40個循環。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL無水乙醇，置-70℃ 30min。離心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。 將沉淀DNA干燥后溶于TE緩沖液中，保存在-20℃。
3. 制備抗體-親和素-DNA復合物
將生物素標記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的生物素標記的DNA片段，繼續孵育30min，最后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結合部位飽和。
最后過凝膠過濾柱將復合物與未結合的單體分開，加入BSA達1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。
4. 免疫PCR
（1） 按常規ELISA方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃過夜。
（2） 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封閉液（PBS含10mg/mlBSA，1mg/ml魚精DNA），室溫孵育30min。
（3） 用TETBS（其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3）洗三次。
（4） 將抗體-親和素-DNA復合物稀釋于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml魚精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室溫孵育1h。
（5） 用TETBS洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulPCR反應液，含有表成分：