冷凍切片 1、取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上冰凍，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結成白色冰體即可切片（1~3分種）。 2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。 3、調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5~10μm間。 4、調好防卷板。制作冰凍切片，關鍵在于防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，準確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，以切出完整、平滑的切片為準。切好的組織在干凈的玻片上黏附時順著一個方向稍微用力輕輕一帶 ，可避免組織攤片過程中皺折 ，保證組織結構的完整及切片的美觀。 注：①包埋劑的選用：包埋劑是對冷凍切片質量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過多或過少都會影響標本冷凍質量。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水。B超藕合劑適用于細胞豐富質地較嫩的組織，普通膠水或 OCT劑適用于纖維豐富質地偏硬組織。 （OCT包埋劑驟冷時固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優點。） ②組織塊過小：先將少量膠擠在托架上預先放在冰凍機中冷凍，約30秒鐘左右待膠凝固時將小組織放上，組織周圍再加一些膠，再次置于冷凍機中冷凍，這樣組織被墊高，就能快速切出高質量的切片。 ③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據不同的組織而定。溫度過低會導致組織塊過硬，切片碎裂，出現梯田狀薄厚不均或空洞；反之，溫度過高，組織塊硬度不夠 ，切片不易成形或成皺褶。數據圖1供參考。 ④當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。 另者，調高冰凍點。 ⑤用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。 如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發生上述的現象。 四、常用冰凍切片蘇木精—伊紅染色 染色步驟：1、冰凍切片用10%甲醛固定1~5分鐘，流水沖洗2分鐘，蒸餾水浸洗3分鐘。 2、蘇木精1~2分鐘。自來水快洗。 3、0。5%鹽酸乙醇分色1~2秒。 蒸餾水快洗。 4、0。25%~0。5%氨水藍化，幾秒種或至組織變藍，自來水洗30秒~1分鐘。光鏡下檢查細胞核分色程度。 5、1%伊紅1分鐘。蒸餾水快洗。 6、80%、90%、95%乙醇速洗，每級數秒到十幾秒。光鏡下監控細胞核與細胞質量顏色對比。 7、100%乙醇2次，每次1~2分鐘。 8、二甲苯2次，每次1~2分鐘。中性樹膠封固。 注：①結束階段的二甲苯作用為透明，其目的是增強標本的折光率，達到光鏡下清晰觀察染色結果。標本內若含水分可降低其折光率，導致光鏡觀察細微結構不清楚的結果。 另二甲苯透明后有得于組織細胞的長久保存。 ②HE染色的水洗：整個染色過程中共5處涉及到水洗，但其洗滌程度及作用均有所不同。 蘇木精染色前的水洗為蒸餾水浸洗：切忌自來水替代蒸餾水浸洗，否則蘇木精染液由弱酸性（棕紅色）轉變為弱堿性（藍色），導致“有色沉淀”出現與積累，致使染色結果為黑藍色。 蘇木精染色后的水洗為自來水洗，伊紅染色后的水洗為蒸餾水快洗，作用是洗去未與組織相結合的染料成分，即洗去“浮色”。伊紅染液為水溶性溶液，浸洗時間長會使組織的伊紅顏色減退。 分色后的水洗為自來水快洗，目的是終止分色液（0。5%鹽酸乙醇）對組織細胞的分色作用。 過度分色將致使染色強度減弱，影響蘇木精與伊紅顏色的匹配。 藍化后的水洗為自來水沖洗，洗掉組織中多余的堿性成分（淡氨水），為伊紅染色提供適宜的染色環境。 五、冰凍切片的快速染色法 ① 切片固定30秒-1分鐘。 ② 水洗（10秒）。 ③ 染蘇木素3-5分鐘。自來水沖洗片刻。（在組織上加蘇木精染液數滴，放在漂片機上的烤板上加熱一分鐘。染液不能干） ④分化（1%酸乙醇分化）。 ⑤ 于堿水（氨水）中返藍20秒。 ⑥ 伊紅染色10-20秒。 ⑦脫水，透明，中性樹膠封固。 注：固定液的選擇 A中性福爾馬林溶液 B 95%乙醇 C AF(40%福爾馬林10ml,95%乙醇90ml) D Carnoy（純乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml） E Clzrke改良液[4]（純乙醇95ml，冰醋酸5ml） F Bouin液（飽和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液 25ml，冰醋酸5ml） 6種固定液固定后的組織切片染色效果各有差異，其中C 固定液固定的切片染色效果最好，組織結構清晰，核染色鮮艷，核無明顯腫脹，核漿對比度好，鏡下與石蠟切片相似（圖1）。 D 液、E 液、F 液染色效果均較好，結構較清晰， 核染色較鮮艷，但核有腫脹，核輪廓有些模糊。A 液染色效果較差，組織結構尚清楚，但細胞核腫脹比較明顯且境界模糊不清（圖2）。B 液染色效果差，核著色不良，結構模糊。 甲醛、乙醇、冰醋酸