（三）Northern blot
用于RNA分析，電泳條件與轉膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時加電醛防止RNA發夾結構形成。其它步驟相同。
為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小時，滅菌水淋洗干凈，100℃干烤15分鐘。不能干熱滅菌的試劑等，也可加1％DEPC處理12小時（但不能用于Tris）后，100℃。加熱15分鐘（或高壓滅菌15分鐘）以抑制、分解RNase。1.0g瓊脂糖，滅菌水80ml加熱溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，滅菌水至1000ml。樣品緩沖液，x50TAE20μl，50％去離子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混勻。約10-30μg/10μl純化的RNA樣品，加二倍（20μl）樣品緩沖液（可點樣一個凝膠孔lane）。60℃水浴15min，馬上置冰浴。加1/10電泳指示劑。點樣電泳，75-80V電泳4-5小時（指示劑泳動7～200px），結束電泳。電泳期間正負極緩沖液要不斷交換（可用蠕動泵），以免pH改變。電泳結束，將凝膠放在紫外光下可觀察到人rRNA大亞基28S（5.1kb），小亞基18S(2.0kb)，記下大小亞基移動距離（或拍照），可作為被測mRNA分子量分析的參照物。凝膠在50mmol/L NaOH中變性30分鐘（低濃度堿，此步可省）。膜在10xSSPE中浸20分鐘。用10xSSPE轉移過夜（同Southern blot）。80℃1-2小時干燥。用探針雜交后，顯影或顯色。
（四）原位雜交（insitu hybridization）
在保持細胞形狀條件下，進行細胞內雜交，顯影或顯色。用于DNA或RNA分析。
細胞用離心涂片機涂片或組織切片置于載玻片上。4％多聚甲醛（PFA）/PBS固定（固定時間因標本而異10-20分鐘，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/L CaCl2的0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.3，500W微波爐中照射10-20秒，固定）。馬上用PBS洗標本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分鐘（因標本和固定條件而定）處理。磷酸鹽類緩沖液（PBS NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO48.1mmol/L，KH2PO41.5mmol/L）洗滌。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分鐘。預雜交：42℃，1小時。預雜交緩沖液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐溫－20，250μg/ml鮭魚精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。雜交：42℃，4小時。用2x雜交緩沖液（4xSSC，0.2mol/L磷酸鈉pH6.5，2xDenhardt）溶解已標記探針，使其終濃度為0.1-1.0μg/ml。DNA檢測時把探針覆蓋在標本上，置100℃5分鐘（變性）取出，雜交。mRNA檢測則先把探針置95℃水浴3分鐘，立即置冰水浴，再覆蓋標本上進行雜交。覆蓋標本用液量100-200μl洗滌：2xSSC，50℃過夜。0.2xSSC，室溫1小時。載玻片浸在緩沖液中。顯色（試劑、方法參照斑點雜交的封閉-顯色部分）20分鐘-2小時，顯微鏡下觀察結果。
二、核酸擴增技術
通過大腸埃希菌繁殖而增殖重組質粒，也是擴增核酸的手段。但在試管中有效擴增DNA的方法，是在90年代才開展起來的多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）新技術。由于PCR靈敏度高、特異性好、操作方便，在我國發展很快。目前，PCR技術結合分子生物學實驗技術（如逆轉錄反應雜交技術等）開發了許多PCR新技術（reverse transcriptase PCR；PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；熱啟動PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于點突變分析；二次PCR特異性好，靈敏度高；熱啟動PCR可提高特異性。
PCR技術原理是在了解DNA一級結構基礎上設計引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可識別并結合引物，以單鏈DNA為模板，dNTP為底物，合成其互補鏈。通過反復變性，反復合成互補鏈的過程，達到DNA擴增的目的。人的DNA擴增引物長度多為20個核甘酸。
PCR反應：DNA樣品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，gelatin（明膠）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，礦物油一滴。93℃7分鐘→50-55℃2分鐘→70-72℃3-1.5分鐘→93℃2分鐘。
將反應物和Marker點樣于凝膠一起電泳，紫外光下觀察結果，拍照保存結果。反應物也可用于印跡（雜交）實驗、多態分析、探針制備等。
注意事項：①DNA樣品純度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆轉錄酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②設計的引物分子內（特別3′端）和引物，1，2分子間不形成雙鏈。選擇性好，不增幅目的DNA以外區域的DNA。引物的G＋C含量為40％-60％。③dNTP濃度過高易使Taq酶合成錯誤，一般在200μmol/L，有人建議40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L對酶有抑制作用。Mg2+濃度過高，NDA不易變性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶從嗜熱菌分離得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐熱每經過一次熱變性要補加一次酶），現在經基因克隆的重組體產物Taq酶最適pH8.3～8.8（室溫8.3-8.4），反應溫度75-80℃，95℃以上失活明顯。無3′→5′校讀活性，對SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐溫－20可抵制SDS抑制）。該酶有逆轉錄酶活性。⑥退火溫度一般設定為Tm－5℃，但實際上與引物一級結構序列有關，設計不當可造成非特異性退火，而造成非特異擴增，此時應調整溫度和相應的時間。⑦循環次數受到的影響因素較多，增加次數可提高靈敏度，但易出現非特異擴增。⑧PCR靈敏高，被檢樣品極易被污染，樣品純化，擴增，檢測區域應分開。房間應經常用紫外光照射。擴增物應定點丟棄，處理。
三、核酸限制性片段長度多態性（RFLP）分析
RFLP分析是限制性內切酶、核酸電泳、印跡（blot）技術、探針-雜交技術的綜合應用，多用于臨床遺傳性疾病的基因診斷。基本原理是遺傳性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、編碼區小范圍核苷酸序列改變或點突變等。前二者可將純化的正常人和病人DNA同時用限制性內切酶切成片段，經電泳分離、印跡、探針雜交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性內切酶切開的片段（分子量）大小與正常人發生差異（限制性片段長度多態），使其電泳遷移率發生差異，而達到基因診斷的目的。小區域或點突變，可選用一個限制性內切酶的切點正好在這一變異位置，使切割作用和正常人發生差異（如正常人基因可切斷而患者不能，或反之），達到診斷目的。現在PCR產物經變性為DNA單鏈，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，只要有一個核苷酸發生變異，其電泳遷移率就會改變，進行多態分析（PCR-SSCP）。實際上把基因的異常位置設計在PCR擴增區域內，就能進行多態分析。（圖18-8）
核酸純化→內切酶作用→電泳分離→Southern blot→探針-雜交→顯影，顯色
四、核酸一級結構（核苷酸序列sequence）分析
核酸一級結構分析是基因分析最直接的第一手資料。目前DNA、RNA以及蛋白質的一級結構分析中，DNA的堿基序列分析方法多樣、簡單、快速。下面就M13噬菌體-雙脫氧核苷酸（ddNTP）的DNA測序法介紹如下。
M13是單鏈DNA噬菌體，轉染宿主菌體復制為雙鏈增殖，又以單鏈形式透出菌體。把待測DNA重組插入雙鏈M13復制型DNA中，經培養擴增，可分離得到單鏈M13DNA（含待測單鏈DNA的堿基序列），即復制模板。在待測DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，復制鏈延長。在ddNTP（2′,3′雙脫氧核糖核苷三磷酸）存在下，復制延長隨機受阻，形成分子量（長度）大小不等的片段。電泳分離，自顯影，讀圖18-9分析堿基序列。
0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝膠，高壓（1600V）電泳，可分辨一個核苷酸的差異。電泳后干燥凝膠，自顯影，自下往上讀圖，得到5′→3′的合成鏈堿基序列，其互補鏈是待測DNA的3′→5′堿基序列。