對10 條肽段的分析結果匯總(表1),結果表明,3 種DIA 方法在fg ~ pg 數量級肽段范圍內均顯示出良好的線性、重現性和靈敏度。3 種方法的最低定量限均達到amol 級,其中肽段GEEMEEMVQSAR在DIA 中最低定量限達14 amol,超越了常規SRM 和PRM 的定量水平。比較3 種方法可以看出,DIA與WiSIM-DIA 結果差異不大,證明了基于高分辨的二級定量和基于超高分辨的一級定量選擇性相當,均能有效排除基質和共流出肽段的干擾,定量能力出色。兩種方法又各有特點,形成優勢互補:DIA 通過四極桿和Orbitrap 兩級篩選,能有效分析極復雜的樣品;WiSIM-DIA 使用母離子定量,避免了碎裂過程中的損失,在相對簡單的基質中靈敏度更高。
表1 3種數據非依賴性采集的線性范圍、重現性、靈敏度
Table 1 Linearity, reproducibility and sensitivity of the three DIA methods
3. 4 直接搜庫鑒定的考察與比較
由于選擇窗口過大,同時二級譜圖無法與一級母離子相關聯,傳統數據非依賴性采集無法直接搜庫,需要譜圖庫匹配才能進行定性確證,使DIA 的應用受制于DDA。
Full MS-DIA 基于一級全掃描定量,母離子未經過前級質量分析器選擇,因此相比DIA 和WiSIM-DIA 受到的干擾更大,靈敏度略低。但是,Full MS-DIA 將二級選擇窗口縮短到3 amu,與傳統DDA 的選擇窗口相當,能夠作為低分辨數據,直接用于數據庫檢索(相當于母離子質量精度為依1. 5 amu),擺脫了譜圖庫的限制,實現了DDA 與DIA 的統一。
圖4 展示了肽段YLGYLEQLLR 譜圖的直接搜庫結果。DDA 通常以2 amu 為選擇窗口,與Full MS-DIA 3 amu 選擇窗口相差不大。搜庫時,Full MS-DIA 一級質量精度以窗口寬度為限,即依1. 5 amu,類似于低分辨質譜DDA 數據的搜庫鑒定。結果顯示,Full MS-DIA 與DDA 的二級譜圖高度相似,雖然Full MS-DIA 譜圖等同于低分辨數據,但鑒定結果沒有明顯差異,序列匹配完全一致。
圖4肽段YLGYLEQLLR 譜圖與搜庫鑒定結果。(A) DDA 和(B) Full MS-DIA 的一級選擇窗口和二級鑒
定圖
Fig. 4Spectra and database search results of peptide YLGYLEQLLR. MS isolation window and MS/ MS identifica-tion of (A) data dependent acquisition (DDA) and (B) Full MS-DIA data
為了考察Full MS-DIA 用于搜庫鑒定的可行性,實驗進一步對100 ng Hela 細胞全蛋白進行DDA 和Full MS-DIA 采集,數據使用Uniprot 人類蛋白數據庫搜庫鑒定(表2)。其中,DDA、Full MS-DIA 一級質量精度分別為10 ppm、1. 5 Da,二級質量精度均為0. 6 Da,卡值標準為q<0. 01 (Percolator)。結果顯示,DDA 共鑒定15575 條肽段,對應3228 個非冗余蛋白;Full MS-DIA 共鑒定10515 條肽段,對應2835 個非冗余蛋白。后者鑒定結果少于前者,主要是兩者掃描范圍不同造成的,Full MS-DIA 需考慮掃描點數,因此掃描范圍較窄;此外,兩者蛋白數的差異明顯小于肽段數,這是由于非冗余肽段主要集中在m / z 400 ~1000 范圍,掃描范圍較窄對蛋白鑒定影響較小。
表2 100 ng Hela 細胞全蛋白樣本DDA 與Full MS-DIA 掃描參數、搜庫參數和鑒定結果(n =3)
Table 2 MS scan parameters, database search parameters and identification results of DDA and full MS-DIA analysis of 100 ng Hela cell tryptic digest (n =3)
DDA 與Full MS-DIA 的蛋白鑒定結果重合度高,表明質量精度對鑒定結果影響不大(圖5A)。通過比較肽段VVIGMDVAASEFFR 的二級譜圖匹配可以看出,兩種方法采集的二級譜圖非常相似,碎片匹配也幾乎一致(圖5B)。以上數據證明,Full MS-DIA 可以直接用于數據庫檢索鑒定蛋白,并獲得可靠的鑒定結果,實現了DDA 與DIA 的統一。
圖5 100 ng Hela 細胞全蛋白樣本DDA 與Full MS-DIA 鑒定結果比較。(A) 兩種方法蛋白鑒定結果比較;(B) 兩種方法二級譜圖匹配比較(肽段VVIGMDVAASEFFR)
Fig. 5 Comparison of identification results of 100 ng Hela cell digest by DDA and Full MS-DIA methods. (A) Comparison of identified number of proteins, (B) Comparison of identified MS/ MS spectra (peptide VVIGMD-VAASEFFR)
4結論
基于靜電場軌道阱Q-qIT-OT 質譜建立DIA、WiSIM-DIA、Full MS-DIA 3 種數據非依賴性采集方法, 并使用添加10 條低濃度肽段的Hela 細胞全蛋白樣本對方法進行考察。結果表明,3 種方法的定量限均在14 ~435 amol 范圍內,線性關系與重現性良好,定性確證可靠性高。其中,WiSIM-DIA 基于超高分辨SIM 定量,與經典DIA 二級定量具有一定的互補性;而Full MS-DIA 將二級選擇窗口縮短到3 amu,實現了DIA 數據直接搜庫鑒定,共從100 ng Hela 細胞全蛋白樣本鑒定到2835 個非冗余蛋白,與DDA 鑒定結果重合度高。基于Q-qIT-OT 的創新數據非依賴性采集方法為定量蛋白質組學提供了全新視角與策略。
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Quantification Analysis of Targeted Proteins in Complex Sample by Novel Data Independent Acquisition
ZHANG Wei1 , Reiko Kiyonami2 , JIANG Zheng*1 , CHEN Wei1
1(Thermo Fisher Scientific, Shanghai 201206, China)
2(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)
AbstractData independent acquisition ( DIA) is a novel MS scan mode for quantitative proteomics,acquiring all precursors as well as fragments without any loss of low abundant ions, and breaks the throughput limitation of product ion quantification by high-resolution MS. Here we developed three DIA methods on quadrupole-linear ion trap-Orbitrap (Q-qIT-OT) Tribrid MS, classic DIA, as well as novel wide isolation window SIM scan (WiSIM)-DIA and full scan-DIA (Full MS-DIA). Quantitative analysis of 10 low abundant peptides spiked in Hela cell digest was performed by the three methods for linearity, reproducibility and sensitivity evaluation. The results showed that the LOQs reached amol level (14 -435 amol) with good linearity and effective MS/ MS confirmation. WiSIM-DIA utilizes ultra-high resolution SIM scan for quantification complementary with classic DIA. The isolation window of Full MS-DIA was down to 3 amu, and the data could be directly used for database searching, thus realizing the integration of data dependent acquisition (DDA) and DIA, and avoiding the limitation of using spectra library.
Keywords Orbitrap; Data independent acquisition; Proteomics; Absolute quantification
(Received 24 April 2014; accepted 4 July 2014）