獲得高水平表達與重折疊是不同的主題，在此不會進一步討論(可見本部分的第12章
)。許多系統可以獲得占總細胞蛋白質1 0 % ?4 0 % 的目標蛋白質表達水平(Mak r i d e s，1996; M u r b y
et al.， 1996; Sorensen and M o r t e n s e n， 2005; Studier et al,，
1990)(見本章 第 9 節）。通常
，研究者需要做實驗以確定在什么溫度下培養細胞、使用多少誘導劑以及誘導多長時間。當目標蛋白質實現髙水平的誘導表達后,
通常會將細胞離心，然后凍存于一80°C 待用。有些說法認為，將細胞凍存數周會使得包涵體難以重折疊，但據我的經驗
，我們可以使用凍存了數月的細胞做出很好的重折疊效果。然而遺憾的是, 據我所知，
尚無系統的研究探討這一問題。
我 們 最 初 用 2 % 的 去 氧 膽 酸 鈉（sodium deoxycholate)洗 滌 包 涵 體（Burgess andKrmth， 1996; N g u y e n e t a l ., 1993) ，但后來發現1% 的 Triton X-100效果更好、使用更方便 。強 烈 推薦大家使用我稱為「美食家」（g o u r m e t) 的 Triton X-100[Pierce,Surfact A m p s X -100, 1 0 % (m /V )溶液], 其經過純化除去有時會在舊的淡黃色瓶子里保存的T r i t o n X -I O O 中發現的過氧化物后，保存在密封于安瓶瓶(am p o u l e) 的氮氣中。可以嘗試用不同的鹽和去污劑作用以觀察哪一種能夠更有效地洗出包涵體中的雜質，而同時又不會溶解目標蛋白質，有時候也可以用1?2 m d /L 的尿素洗滌。一般來說，在溶解包涵體之前，需要洗掉盡可能多的膜成分、D N A 及其他蛋白質。
如之前所說，有 些 包 涵 體 蛋 白 接 近 天 然 狀 態 ，用 溫 和 的 條 件 ，如 非 離 子 去 污 劑(nonionic detergent)或者甚至 0?5 m o l / L N a C l 就可以將其溶解（V e r a et al.， 2006)。大多數情況下，這種做法是不行的，而是需要使用更強烈的變性條件。
與前面的裂解緩沖液一樣，促溶劑/變性劑（solubilizing
agent/denaturant) —般溶于緩沖液中，以控制 p H 、螯合重金屬以及維持還原的環境。通常 ，用促溶劑重懸包涵體, 孵育
30?60 min，然后離心除去不溶的物質。由于包涵體中的蛋 白 質
至少是部分變性的，所以溶解可在室溫下操作，有時甚至需要給溶液加熱以實現完全溶解。例如，當把天然的
綠色突光蛋白（green
fluorescent protein，GFP)溶 于 6 m ol/L 鹽 酸 胍 時 ，在室溫下其仍然具有熒光，但 在 75°C條 件 下
，其 會 在 I mi r i以 內 變 性 并 失 去 熒 光（R. Burgess和 N.T h o m p s o n ，未 發 表 的 結
果）。 對 促 溶 作 用 更 詳 細 的 論 述 可 參 考 Marston和 Hartley(1990) 的文獻。
下面是對幾種促溶劑使用上的評論。
(1)鹽 酸 胍 它 可 能 是 最 常 用 的 促 溶 劑 ，通常 其 在 相 容 緩 沖 液 中 的 使 用 濃 度 為6 m o l /L 。在這種強的離液劑中 (chaotropicagent)，大部分蛋白質會迅速變性，但許多時候在較高溫度下孵育會有助于實現蛋白質完全變性。一旦溶解后，稀 釋 至 3 m o l /L 鹽酸胍通常也沒有問題, 因為從變性狀態到天然狀態的變化通常發生于1?2 m o l /L 鹽酸胍的水平 (P a c e, 1986)。通常稀釋至約0.1 m 〇l/L 鹽酸胍就可以實現足夠低的鹽水平，以保證重折疊的目標蛋白質結合于離子交換層析柱 (見下文)。
(2) 尿 素 8 m o l / L 尿素是常用的促溶劑，尤其用于在變性狀態下進一步純化目標蛋白質( K r m t h and Burgess, 1987)。 一 般 8 m o l / L 尿素在促進蛋白質溶解和使蛋白質完全變性方面不如 6 m o l / L 鹽酸胍那么有效。必須注意到總是存在于尿素溶液中的氰酸鹽(cyanate) 可能引起蛋白質的氨甲酰化(carbamylation)(本 書 第 4 4 章對如何盡量降低尿素中的氰酸鹽提出了建議)。
(3) 十二烷基肌氨酸鈉或十二烷基磺酸鈉（sarkosyl或 S D S ) 研究者發現, 十二烷基 肌 氨 酸 鈉 作 為 有 效 的 促 溶 劑 ，能 夠 幫 助 蛋 白 質 在 更 高 的 濃 度 下 重 折 疊（Burgess，1996)。十二烷基肌氨酸鈉是一種很強的陰離子變性劑, 很像S D S ，但其與蛋白質結合得更 弱 ，比 S D S 更易解離。通常包涵體可以溶解于0. 3% 的十二焼基肌氨酸鈉, 但必須注意的是不能用十二烷基肌氨酸鈉溶解等于或超過自身重量的蛋白質。例 如 , 如果你要溶解含 有 150 m g 目標蛋白質的洗滌過的包涵體, 用20 m L 0. 3 % 的十二烷基肌氨酸鈉(60 m g十二烷基肌氨酸鈉)不能溶解完全。你必須加人至少50 m L 0?3 % 的或者30 m L 0. 5 % 的十二烷基肌氨酸鈉。
我們注意到, 如果在包涵體中存在許多Triton X -100，那么需要更多的十二烷基肌氨酸鈉來溶解目標蛋白質。幾乎可以確定，其 原 因 是 Triton X -100可以形成大的微團, 并且可以吸收一些十二烷基肌氨酸鈉形成混合微團，而微團是沒有促溶解作用的。
如
果 將 0. 3% 的十二燒基肌氨酸鈉溶解的目標蛋白質稀釋至約0?01 % 的十二焼基肌氨酸鈉,
大部分十二烷基肌氨酸鈉就會從蛋白質上解離下來,
蛋白質就會重折疊。殘余的去污劑似乎是與部分重折疊的蛋白質的疏水區(黏性位點)結合，從而阻止聚集作用。其就 如 同 化 學 伴
侶（chemical chaperone)— 般 發 揮 作 用 。如 果 你 的 目 標 蛋 白 質 能 夠 和P O R O S H S
之類的陽離子交換柱(cation-exchange c o l u m n)結合, 那么稀釋后的溶液可以經過過濾，然后泵人1〇 m L
的柱子，用 10?2 0 個柱體 積 的 0.1 m o l /L 的 N a C l 緩沖液沖洗 ，然后用鹽濃度梯度洗脫(見 本 章 5. 5
節），目標蛋白質將會結合在柱上，而游離的十二焼基肌氨酸鈉則會流穿，結合在蛋白質上的殘余的十二烷基肌氨酸鈉也會在長時間沖洗中解離。對洗脫蛋白質的實驗分析表明，蛋白質中基本上沒有(10個蛋白質分子中少于1個十二院基肌氨酸鈉分子)殘余的十二烷基肌氨酸鈉（R
. B u rgess, 未發表數據）。不要
用 M o n o S 柱做此工作，因為十二烷基肌氨酸鈉會同該柱子結合，并損壞柱子，而且會污染你的洗脫蛋白質。
SDS也可以以類似的方式使用，但必須注意的是，使 用 的 SDS不能含有長的鏈烷烴(alkane)，如 C14、C1 6 等 。用 在 S D S 中 變 性 的 G E P進 行 的 重 折 疊 實 驗 效 果 很 好（R.Burgess、N. Thompson和 R. Chumanov, 未發表數據），因此應該考慮使用SDS作為有效的促溶劑。
已有相關文獻報道利用陽離子變性劑氯化十六烷基三甲基銨(cetyltrimethylammo-nium chloride，CTAC)成功實現了蛋白質的促丨谷和重折疊 (Puriet al.，1992)。 即使是鹽濃度非常低的蒸餾水也能取得促溶效果(S o n g ， 2009)。
假設你已經按如下方法進行了重折疊實驗，那么最基本的稀釋變性劑的方法就是將溶解的蛋白質稀釋入合適的重折疊緩沖液中。然而，這 里 有 3 種方法可用于重折疊稀釋。
(1) 反向稀釋(reverse dilution) 將重折疊緩沖液加至變性蛋白質中，每次加時都要混 勻 。該方法已有數個成功的例子[如G r i b s k o v和 B u r g eSS(1983)]。然 而 ，仔細想想就會知道，這種稀釋方法無疑會在蛋白質開始重折疊的關鍵時期產生最髙的蛋白質濃度。例 如 ，如果蛋白質以I m g /m L 的濃度溶解于6 m o l /L 鹽酸胍，那么如果加入2?5 體積的重折疊緩沖液(稀 釋 至 1?2 m o l / L 鹽酸胍），就可能會在蛋白質濃度為 330?160 ug/mL時經歷重折疊的過渡狀態。
(2) 瞬間稀釋（flash dilution) 將變 性 蛋 白 質 快 速 加 入 重 折 疊 緩 沖 液 。例 如 ，將10 m L 6 m o l /L 鹽酸胍中的重折疊蛋白質一次性加入590 m L 的合適的重折疊緩沖液中以稀釋60倍, 同時快速混勻。在重折疊時, 蛋白質濃度會成為16ug/m L ，遠低于反向稀釋的水平，導致蛋白質聚集的可能性較小。
(3)
滴注稀釋(drip dilution) — 滴一滴地非常緩慢地將變性蛋白質滴人重折疊緩沖液中，滴加需要 I h 。理論上,
這應當是最佳的方法，因為蛋白質總是在極低的濃度下進行重折疊[參見S i n g h 和 P a n d a (2005) ,Vallejo和
Rinas(2004)的綜述]。例如，如果你將 0.1 m L 上述溶解的蛋白質滴入590 m L
重折疊緩沖液中，那么蛋白質濃度只有〇.16ug/m L。因為你滴入的樣品量增加得很少，所以蛋白質總是保持在低濃度,
而且當最后一滴被加人時，蛋白質濃度為16ug/m L。然而 ，如果變性蛋白質經過了 I h
的滴加，而且蛋白質有效地重折疊至天然狀態的半數重折疊時間只有1?3 m i n
，那么部分重折疊的黏性蛋白的濃度總是很低，因而它們就不會發生聚集。耗 費 i h
，一滴一滴加人溶解蛋白，這會讓人感到厭煩，但可以使用設置為極低流速的蠕動泵將變性蛋白質在I h
這段時間內加人。這樣做的重復性更好，而且顯著減少了研究生的精力消耗。
蛋白質稀釋后將其靜置30?60 m in，然后按常規流程中介紹的那樣進行過濾。否則 ，當將蛋白質溶液上樣至柱子 (見下文)時，非常小的顆粒狀的物質就可能會堵塞柱子，引起壓力升高，從而使實驗中途失敗，或是需要將流速降得很低以至于上樣就要花費數小時。