合適的小鼠胚胎干細胞胞質分裂阻斷微核試驗CBMn分析

實驗概要

觀察表明，加入細胞松弛素-B到小鼠胚胎干細胞（mESC）的培養誘導細胞凋亡作CBMn分析。另一方面，加入 cyt-B是（CBMn）技術的最關鍵的部分。因此，改變傳統CBMn分析方法是必要的。在本實驗中，我們試圖解決這個問題。研究表明，CBMn可作為一個可靠的工具用于胚胎干細胞研究，特別是在監測細胞遺傳學的完整性。對觀察mESCs誘導凋亡的潛在原因進行了討論。

主要試劑

2-巰基乙醇(Sigma；M-7522)

原液的濃度為14.3 M(純液體)，準備β -巰基乙醇溶液的工作液，加入70μl 2-巰基乙醇原液(14.3M)溶于10 ml PBS ，過濾消毒和儲存在陰涼的地方。

Bisbenzimide H 33258，(Calbiochem，382061，100 mg)

杜爾貝科的磷酸鹽緩沖生理鹽水無 Mg²和Ca² (D - PBS)(Sigma；D5652)。不要加熱，立即過濾消毒。

二甲基亞砜(Sigma，Hybrimax，無菌過濾；D2650)

EGTA粉(Sigma，E-4378)EDTAD對鎂具有高親和力，對鈣具有較低親和力，而EGTA具對鈣具有高親和力，對鎂具有較低親和力。EGTA工作濃度為2mM。

胚胎干細胞適合的胎牛血清(ES FCS)，(Gibco；16141-079)FCS可能包含可以促進胚胎干細胞分化的不確定因素，因此每批產品必須事先篩選。

小牛血清(FBS)，(Invitrogen，10270-106)在-20oC 保存，用前37oC水浴解凍。解凍后，胎牛血清可保存于4oC，3-4周。

注意：避免反復凍融胎牛血清。

明膠(Sigma；G2500)

L-谷氨酰胺溶液(Gibco；25030-024)

白血病抑制因子(LIF)(ESGROTM；13275)此因子通常被用來協助維持mESCs的多能性。

絲裂霉素C粉(Sigma；M0503)請注意，在培養基中的MIT-C(38℃)中含有抗生素和血清，隨著時間的推移而降解。

非必需氨基酸(Gibco；11140-035)。

胸苷粉(Sigma；T1895)

胰蛋白酶EDTA(1X)的HBSS無Mg² 和Ca² (GIBCO 25300-054)，(pH值7.8-8.7)

實驗步驟

試劑配置：

1. BD基底膜?(BD Biosciences；cat. #354277)

由于基底膜?矩陣超過10℃形成凝膠，應保持在一個較低的溫度。因此，所有的設備和試劑使用前應被冷藏冰上。基底膜?準備，從原液中添加350μL到6 ml 預冷媒介。4℃解凍基底膜?。

2. 細胞松弛素B(Cyt-B)(Sigma；C6762)

將5毫克的固體細胞松弛素-B溶于1毫升的二甲基亞砜。按以下方法配置濃度5000Cμg/ml的Cyt-B (1000倍溶液)：

   1) 從-20℃取出置于室溫下，不要取下密封蓋。

   2) 用70％乙醇消毒橡膠密封件的頂部，讓乙醇蒸發。

   3) 用2.5毫升無菌注射器，通過密封蓋注射1毫升DMSO。

   4) 輕輕搖晃混合物。細胞松弛素-B的容易溶解在二甲基亞砜。

   5) 混合，混懸1000倍50μL的原液，分裝到0.5毫升無菌聚苯乙烯管。標注日期和 “CYT-B”

   6) 儲存在-20oC，12個月，小瓶粉末保證2年。

   7) 分別加450μL和4950μL的DMEM培養液，制備100倍和10倍的Cyt-B 。

注意：細胞松弛素-B的是有毒的，它可能是致畸劑。

3. DMEM培養基：飼養層的生長需要。

   1) DMEM培養基(Gibco；12800 -116)13.5 g/ L

   2) 碳酸氫鈉(Sigma；S-5761)3.7 g/ L

   3) 青霉素/鏈霉素(Gibco；15070-063)10 ml/L

   4) 鹽酸(1 N)的3 ml/L

   5) 2 -巰基乙醇(Sigma，M-7522)7 μL

將以上成分加入燒瓶中，攪拌加入1N NaOH或1N鹽酸調整比預期的工作pH值(7.0-7.4)低0.2-0.3單位。碳酸氫鹽緩沖溶液的pH值通常在過濾時提高0.1-0.2單位。

4. 胚胎干細胞培養液

   1) Knock-out? DMEM培養基(Gibco；10829-018)500毫升

   2) 青霉素/鏈霉素(Gibco；15070-063)5毫升

   3) 非必需氨基酸(Gibco；11140-035)5毫升

   4) 2 -巰基乙醇(Sigma，M-7522)0.5毫升

   5) ES-FCS(Gibco；16141-079)75毫升

分裝避光保存于于4oC。50毫升KO-DMEM，500μLL-谷氨酰胺和50μL LIF是需要的

5. 明膠處理瓶

   1) 添加3-4毫升0.1％的無菌明膠覆蓋于T-25細胞瓶的底部。

   2) 37℃靜置1小時。

   3) 從涂層表面移除多余的液體，讓干燥的空氣流通約1/2小時(或者可以允許風干過夜)。

   4) 在加入細胞前細胞瓶用用無菌組織培養液或平衡鹽溶液沖洗。

6. 絲裂霉素C處理小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)

   1) 在14天mEF融合后加入培養液。

   2) 加入200μLMit-C至10毫升細胞培養液，37攝氏度孵育90分鐘。

   3) 加入5毫升PBS 洗三次除去MIT-C。

   4) 消化和懸浮細胞，每個培養瓶加入2.5×10⁶個細胞，值調pH。旋轉和搖晃細胞瓶使細胞分布均勻。成纖維細胞附著，通常需要1-2小時。

7. 胸苷的制備

   1) 0.1816克胸苷粉末溶解在10mlPBS得到75 mM的胸苷溶液(原液)。

   2) 加入100μL原溶液至3毫升培養基(胸苷最終濃度為2.5mM)。

mESC培養基制備：

1．普通的培養條件， ES(胚胎干)細胞生長于 Mit-C((M0503；Sigma，Germany)，將未分裂小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)作為飼養細胞培養于涂有明膠(G2500；Sigma)的組織培養瓶((90025；TPP)。

2．mESC株 RB1 12保持于ES細胞培養基包括Knock-out?培養液(10829-018；Gibco，UK)，輔以15％ES標準的FCS(10439-024；Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(15039-027；Gibco)，0.1 mM 2 -巰基乙醇(M7522；Sigma)，1％氨基酸液(11140-035；Gibco)，100 U / mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素(15070-063；Gibco)。

提示：

小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)是用來在聯合培養提供分泌因子(paracrine element)，細胞外基質(juxtacrine signaling)和細胞接觸因子，維持干細胞未分化狀態避免失去其全能性。因此，他們也被稱為飼養細胞。

繼代培養細胞：

1．預熱所有試劑

2．將所需試劑吸入培養容器中

3．加入2 ml PBS沖洗細胞瓶兩次，輕輕搖動30秒，吸出緩沖液暴露所有媒介含胎牛血清。

4．每個培養瓶加入適量的胰蛋白酶，使之覆蓋整個表面。室溫孵育約1分鐘，快速回來晃動培養瓶4-5次使胰蛋白酶侵入細胞。孵育1分鐘后，吸取胰蛋白酶吹打細胞瓶，使連接松散的細胞脫落和團塊分解。

5．加入新鮮的，完整的介質使胰蛋白酶失活。一定要在胰酶失活前單細胞。

mESCs：

1．加入2 mM胸苷培養16個小時，使得干細胞達到25-30％匯合。

2．加入1X PBS洗滌除去胸苷，加入新鮮的KO-DMEM完全培養液培養4個小時，釋放細胞。細胞達到G2期有絲分裂階段。

hypotonization

基于 criteria by Fenech標準選擇雙核細胞適合MNI，只有每個核的核邊界分離，才可以獲得一個雙核細胞。此外，雙核細胞的胞質膜必須完整和清楚的與從相鄰細胞分離。因此，收集mESCs細胞時胞質膜必須沒有損傷。

單個淋巴細胞或細胞株培養的微核試驗在收獲過程中不需要低滲處理。低滲處理，可能會導致細胞壞死和凋亡，使他們無法檢測。另一方面，mESCs有一個大核被較窄的細胞質包圍。根據上述所述mESCs進行低滲處理是必要的，不能省略。

收集細胞和制作切片

1．將ES細胞生長于含有4 μg/ml cyt-B的 mEF上，培養14小時。

2．胰酶消化細胞和離心6分鐘。

3．重懸細胞沉淀，輕輕拍打管，加入約4 ml低滲溶液。

4．室溫下孵育10分鐘，再次離心細胞降速細胞，用Carnoy`s fixative (甲醇：冰醋酸3:1)室溫固定細胞15分鐘，并修復與酷卡諾的固定液沉淀15分鐘，在室溫下。固定前分散細胞。

5．更換固定液2次。

6．去掉懸浮液，濕玻璃片用乙醇清洗。

7．空氣干燥玻璃片，染色用Hoechst 33258(Calbiochem；382061)，和羅丹明B(Sigma；R6626)。8) 熒光顯微鏡下檢查切片。在我們的研究中，用頻率表示每個雙核細胞MNI的數量(平均值±SD)。

關鍵

干燥切片不要超過10分鐘，否則細胞和分子形態會改變。應將切片保存于儲存在陰涼，干燥，無灰塵的盒子里。

計數

檢測1千個雙核細胞測量MN的形成，每個樣品(治療和對照)。

暫停點：熒光染色切片可以4oC存儲1個月。

微核檢查的標準

MNI形態學特征：原子核更小，具有以下特點：

1．人體淋巴細胞的MNI直徑，通常為核平均直徑的1/16和1/3，這到BN細胞核面積1/256和1/9。

2．MNI不折光，因此，可以很容易地從染色顆粒中區分。

3．MNI不鏈接或連接到主核上。

4．MNI可能接觸但不會與主核重疊。顯微核的邊緣與核邊緣區分。

5．MNI染色強度通常一致，但偶爾染色會更深。(For review see Fenech，2007)。

統計分析：

我們使用t檢驗，評估基因毒性劑誘導MN形成。