哺乳動物組織的勻漿實驗_基本方案

對于細胞內蛋白的純化和特性分析，重要的是選擇一種有效的方法來破碎細胞或組織，使蛋白迅速地從胞內相對隔離的空間中釋放到緩沖液中，而該緩沖液應對所研究的蛋白的生物活性沒有影響。廣泛使用的破碎軟組織的方法之一是勻漿。蛋白酶從其他的細胞區隔中釋放出來的風險很小。可以通過在勻漿緩沖液中加人蛋白酶抑制劑來降低蛋白酶的水解作用。勻漿緩沖液的選擇取決于提取物的性質。一般使用中等離子強度、中性pH值（如0.05?1.0 mol/L磷酸鹽或Tris，pH7.0?7.5)。最適的緩沖液離子強度應該通過反復實驗來優化，以獲得目的蛋白的最高提取率。在許多情況下，勻漿緩沖液中加入蛋白酶抑制劑是沒有必要的（因為目的蛋白周圍有許多其他的蛋白，可以起保護作用）。但是一些蛋白比另外一些蛋白更易水解，并且一些組織（如肝、胰腺）比其他組織（如心臟）有更高水平的蛋白酶。若提取物的體積很大，使用混合蛋白酶抑制劑是昂貴的。因而，要進行幾小時的預實驗來確定目的蛋白是否大量喪失活性。假如蛋白酶水解有礙于實驗，可以在勻漿緩沖液中加入蛋白酶抑制劑。假如蛋白易于被氧化，或是活性被重金屬抑制，則應在提取緩沖液中加入DTT (或β-巰基乙醇）和EDTA。

動物組織

二硫蘇糖醇（DTT)勻漿緩沖液A勻漿緩沖液B

勻漿器離心機粗棉布

方法要點：所有操作均在0?4℃進行。

①從動物中取出組織后，修剪并去除脂類和結締組織，然后放入預冷的勻漿緩沖液A中。

②用切刀把洗好的組織切成小塊（如1cm方塊），或者把這些組織放在絞肉機上攪兩次。像肝臟、大腦、腎和心臟等組織很容易在韋林攪切器中破碎，但是骨骼肌和肺則很難，所以應在勻漿之前先用家用絞肉機來絞碎。許多纖維組織，比如哺乳動物胸腺，必須在勻漿之前冰凍以利于破碎（常用Ultra-Turrex勻漿器）。培養的哺乳動物細胞和少量的軟組織（1?5g)，比如腦，可以使用Dunce手動勻漿器（Dignam,1990)來勻漿。在所有情況下，都要4℃預冷勻漿器和玻璃容器，并且勻漿操作應該在冷室中進行。

③將組織加入3?4倍體積的勻漿緩沖液B中，然后轉移到勻漿器中。

④使用下面的方法來制備勻漿液。Potter-Elvehjem勻漿器：儀器設置在500?1500r/min，勻漿組織數次，每次5?10s。Dounce手動勻漿器：勻漿組織10?20次。韋林攪切器：勻漿組織3?4次，每次20?30s，間隔10?15%

⑤把勻漿液倒入玻璃燒杯，把燒杯放在冰上，在4℃條件下溫和攪動勻漿液30?60min，以便充分提取蛋白。實驗提示：勻漿過程中不要起泡。

⑥4℃條件下10000g離心10?20min，除去勻漿液中的細胞碎片和其他物質。

⑦過濾漏斗中鋪兩層紗布（或加一層玻璃棉）來過濾上清，除去漂浮在表面的脂類物質。小心地擰紗布以便獲得最大量的濾液（稱為“粗提液”）。

⑧盡快用適當的分離方法和分析方法處理樣

勻漿緩沖液A

50mmol/L Tris-Cl(pH7.5) ，2mmol/L EDTA ，150mmol/LNaCl，0.5mmol/L DTT

勻漿緩沖液B

50mmol/L Tris-Cl(pH7.5)，10%(體積分數）甘油或（0.25mol/L蔗糖），5mmol/L醋酸鎂，0.2mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，1.0mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF)