哺乳動物細胞總RNA快速分離

尤鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液 EDTA SDS 乙酸鈉 水平衡的苯酚  乙醇 Tris-Cl  NaCL

一 材料與設備

1)尤鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)
    
2)10 mmol/L  EDTA (pH8.0 )
    
3)0.5% SDS  
 
4)0. l mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 )   

5)水平衡的苯酚   

6)乙醇  

7)l mol/L Tris-Cl (pH8.0 )     

8)5 mol/L NaCL


二 操作方法

1 ) 吸出培養液，用 7m l 冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液 ( PBS) 沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重 復1 次.操 作 時 ，應將平板置于冰上，直至所有單層細胞沖洗完畢。

2 ) 每個直徑 90mm 培 養皿中加 2ml 10mmol/L EDTA(pH8.0 ) 、0. 5% SDS，用刮棒將裂解物刮入一次性使用的 15m l 離心管中。

3 ) 用 2ml 0. 1mol/L 乙酸鈉 （pH5. 2 )、10mmol./L EDTA( PH8. 0 ) 沖洗平板，并將沖洗液移至上述裝有細胞裂解物的離心管屮。

4 ) 將 4m l 水平衡的苯酚，于室溫振蕩 2mm，使之與細胞裂解物混勻，則細胞 DNA 形成白色絲狀沉淀。

5 )于 4 ℃ 以 5000r/ mm 離心 10mm 分相 ，兩相之間可見致密的 DNA 層 。

6 ) 用一支巴斯德吸管將上層 (水相）移至另一個 裝 有 440u1 冰 預 冷 的 lmol/L Tris-Cl( pH8. 0) 和 180ul 5mol/L NaCl  的離心管中。

7 ) 加 2 倍體積冰預冷的乙醇，混勻 ，于 0°C放置至少 30min

8 ) 于 4°C 以 5000r/mim 離 心 l0min 以沉淀 RNA，棄去乙 醇 ，離心管直立倒置直至所有乙醇揮發殆盡。

9 ) 用 200ul 冰預冷的 TE（pH8. 0 )重溶 RNA, 將其移至一個滅菌的微量離心管內，并加5mol/L NaCl、50ul 冰預冷的乙醇，

1 0 ) 用微量離心機于 4°C 以 12000 足離心 5min 以收集 RNA,

11)吸出所有的乙 醇 ，將打開管蓋的離心管置于實驗臺上放幾分鐘，讓最后殘留的痕量乙醇揮發殆盡。

1 2 )用所需緩沖液重溶 RNA。