基于激光剝蝕―ICPMS技術的生物元素成像分析

　　1引言 
　　生物體內的微量元素具有十分重要的生物功能，參與多種生物化學過程[1＼]，如金屬離子常作為蛋白質的活性中心，催化和調節生物體內的化學反應[2＼]。微量元素還與一些疾病的發生發展密切相關[3＼]。研究發現，阿爾茨海默病（Alzheimer′sdisease，AD）患者大腦的沉積斑中有高濃度的銅、鋅、鐵離子[4＼]；金屬離子在腦組織微區內的代謝紊亂、氧化應激與AD的形成和損傷關系密切[5＼]。因此，生物樣品中微量元素的分析和檢測，特別是元素的原位微區分析，無論對于研究微量元素在生物體內的結構、功能和生物效應，還是對于闡明與微量元素相關疾病的發病機理，尋找這些疾病的預防和治療策略，都具有重要的意義。 
　　生物體內微量元素的分析主要使用原子吸收、原子發射、原子熒光、無機質譜等原子光譜/質譜儀器完成。常規方法大都需要使用強酸消化樣品，前處理過程冗長而繁瑣，一般只能得到元素總量的信息，而無法得到元素在生物樣品中的分布信息。如果采用具有空間分辨能力的原位分析方法，如二次離子質譜[6＼]、激光電離飛行時間質譜[7＼]、同步輻射X射線熒光[8＼]、激光燒蝕電感耦合等離子體質譜（Laserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry，LA-ICP-MS）[9＼]等方法，可以實現生物樣品中元素的原位、微區分析，得到元素成像圖。 
　　在上述原位元素分析方法中，LA-ICP-MS由于具有空間分辨率好（約5μm）、分析檢出限低（10 
　　4g/L級）、儀器商品化程度高、運行成本較低等優點，逐漸成為應用最廣泛的元素成像方法[10，11＼]。楊紅霞等[12＼]利用LAICPMS原位分析了印度芥菜中的7種元素，得到了植物莖中的元素分布圖；馮流星等[13＼]將同位素稀釋法應用于LAICPMS的定量分析，建立了生物切片中Fe元素的原位定量分析方法。本實驗詳細描述LAICPMS元素成像的步驟和方法，并將建立的方法應用于鼠腦切片和單個細胞的元素成像分析。 
　　2實驗部分 
　　2.1儀器與試劑 
　　NWR213Nd：YAG激光剝蝕系統（美國NewWave公司）；四極桿電感耦合等離子體質譜儀（NexION300DICPMS，美國PerkinElmer公司）；冷凍切片機（德國LEICA1900）；NuncLabTekII腔室載玻片（美國賽默飛世爾科技有限公司） 
　　本實驗所用小鼠（C57BL/6J）購自中國醫學科學院實驗動物研究所；高純Ar氣和He氣購自北京普萊克斯公司；LAICPMS調諧用標準物質（SRM612），30nm金納米顆粒（RM8012）購自美國國家標準與技術研究院（NIST）；細胞培養基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、鏈霉素均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。 
　　2.2樣品前處理 
　　3月齡正常小鼠麻醉后，用生理鹽水快速灌注15min，再斷頭取腦組織。將腦組織快速冷凍，制成30μm厚的冠狀切片，置于干燥器中備用。 
　　小鼠巨噬細胞（RAW264.7）用含有10%小牛血清（FBS）、100μg/mL鏈霉素、100units/mL青霉素的DMEM/F12培養基在培養箱中（37℃，5%CO2）培養。NIST金納米顆粒超聲處理后，用純水稀釋至合適的濃度，加入細胞培養液。細胞暴露于0.1mmol/L金納米顆粒4h后，JP吸出細胞培養液，用PBS反復清洗后，將細胞轉移至腔室載玻片，待細胞貼壁后，除去腔室間的隔斷，將載玻片置于干燥器中備用。 
　　2.3LAICPMS實驗 
　　激光剝蝕產生的氣溶膠由He氣載帶出樣品ZH（池，通過三通與Ar氣混合后進入ICP-MS分析。ICPMS用NIST612調諧，使U、Th信號最強且得到較低的氧化物產率（UO+/U+）。LA-ICP-MS所用的儀器參數見表1。 
　　LA采用線剝蝕模式，激光剝蝕時自動觸發ICPMS以時間分辨模式采集質譜數據。所得數據用MicrosoftExcel處理，用IgorPro.（美國WaveMetrics公司）軟件畫出元素成像圖。 
　　3結果與討論 
　　激光燒蝕系統可以作為ICPMS的固體進樣裝置，工作時激光束先剝蝕樣品表面，產生的固體氣溶膠被載氣運送至等離子體而完成電離，然后在質譜中得到檢測。LAICPMS的準確分析需要盡可能地滿足下面3個條件：（1）激光剝蝕產生的氣溶膠與固體樣品的組成相同；（2）氣溶膠可以高效率地傳輸至質譜；（3）進入質譜的氣溶膠可以完全電離[14＼]。在實際分析過程中，上CM（203/5述條件常常很難完全滿足，這樣會導致“元素分CM）ZH）餾”（不同元素在LAICPMS分析過程中的行為差異）的產生。為了校正激光能量、樣品厚度、漂移對質譜響應的影響，LAICPMS元素成像分析時，需要選用適合內標元素。還要使用基體匹配的標準，以獲取準確的定量分析結果。研究表明，相比過去常用波長的激光器（如266nm），使用213nm波長的NdKG-3∶KG-5YAG激光剝蝕得到的樣品更為均勻，元素分餾效應更小[15＼]。使用氦氣作為載氣，可以有效地提高氣溶膠的傳輸效率，從而提高分析的靈敏度[16＼]。因此，在本實驗中，使用波長為213nm的激光，采用He氣作為載氣，并采用13C的信號作為內標校正元素。 　　3.1剝蝕模式的選擇 
　　元素成像可采用點剝蝕模式（Spotablation）或線剝蝕模式（Lineablation）完成（圖1）。在點剝蝕模式中，激光在樣品表面每隔一定距離取一點剝蝕樣品，重復操作直到激光采樣的點陣覆蓋整個樣品。在此模式下，采集的數據真實反映每個采樣點上的元素信息，激光光斑越小，采樣點越多，得到的元素成像圖的分辨率越高。而在線剝蝕模式中，在樣品表面每隔一定距離設置一條剝蝕線段，重復設置剝蝕線段，直到激光采樣的線段覆蓋整個樣品。工作時激光沿直線連續剝蝕樣品，此時，元素成像圖的分辨率取決于激光光斑、剝蝕頻率、線掃描速率，以及剝蝕線間的距離等條件。 
　　LAICPMS分析時，如果采用點剝蝕模式，在兩個剝蝕點之間需要耗費較多的時間等待質譜信號回到本底水平，才能進行下一點的分析。這樣減少了有效質譜分析時間的比例，增加了元素成像分析所需要的時間。所以在本實驗中，采用線剝蝕模式，并使用兩種剝蝕參數分別應用于鼠腦切片和細胞樣品（見表1）。需要注意的是，由于剝蝕參數的選擇，最終得到的元素成像圖在激光掃描的方向常會拉長變形，一般需要在最后處理過程中恢復原始比例。 
　　3.2激光能量的選擇 
　　與地質樣品不同，生物樣品的含水量較高，因此在剝蝕時，必須有效地控制剝蝕條件，既要實現完全剝蝕樣品，又要避免用過高的能量剝蝕而使樣品中的水大量汽化，造成樣品不規則撕裂和嚴重的元素分餾。此外，在分析生物樣品時，選擇較低能量密度（<1J/cm2），有利于得到穩定的激光脈沖。有文獻報道，使用低溫樣品池可以有效減少由于樣品中水分汽化而造成的負面影響[17＼]。但是由于低溫樣品池結構復雜，價格昂貴，從而限制了其實際應用。我們發現，通過選擇合適的激光能量，也可以實現對生物樣品的有效剝蝕，而不必采用低溫樣品池。圖2顯示了不同能量的激光剝蝕鼠腦切片的結果，可以清楚地看出，對于本實驗中的鼠腦切片樣品來說，選用40%的激光輸出能量，即可得到較好的剝蝕效果。如果輸出能量大于40%，會導致激光穿透樣品而剝蝕載玻片，從而引入了來自載玻片的元素干擾，還會造成切片樣品的不規則剝蝕。對于實驗中的細胞樣品，經過對比，選用80%的輸出能量可以達到良好的剝蝕效果。 
　　3.3鼠腦和細胞的元素成像圖 
　　元素C作為生物樣品的內標校正元素，Fe，Cu，Zn是生物體中重要的必需微量元素，具有多種生物功能。所以，本研究選擇分析以上元素。LAICPMS分析得到的鼠腦元素成像見圖3。從圖3可以清楚地分辨小鼠腦的不同區域，并可以看出Fe，Cu，Zn等重要微量元素在各個腦區中的分布情況。由于Fe元素在ICPMS中受到ArO+等多原子離子的嚴重干擾，所以得到的Fe元素成像圖不如其它元素成像圖清晰。JP文獻＼[18＼]報道，采用碰撞反應池技術可以消除測量時的質譜干擾，得到更加清晰的Fe元素成像圖。由于缺乏可用于LAICPMS定量分析的生物標準參考物，定量元素成像分析相對困難。國外實驗室常自制基體匹配的生物切片標準物質，采用外標校正的辦法，實現生物樣品的定量元素成像[10＼]。 
　　如果LAICPMS技術與免疫組織化學方法相結合，使用元素標記的抗體與切片上的待測抗原反應，通過分析標記的元素，可以得到切片上蛋白質（抗原）的分布信息，進一步拓展LAICPMS在生物成像分析的應用范圍。Seuma等[19＼]成功得到了兩種癌癥生物標志物在組織上的成像。利用類似的方法，Wang等[20＼]同時得到了Fe，Cu，Zn等金屬元素和β淀粉樣蛋白在老年癡呆模型鼠腦切片中的元素和分子成像圖。 
　　圖4是暴露金納米顆粒后的單細胞光學成像和元素成像圖。在本實驗條件下，除了Mg元素外，不能得到其它天然微量元素的清晰成像。主要是由于細胞中的這些元素含量較低，或者是由于分析這些元素時存在較為嚴重干擾。從圖4可見，Mg和Au元素濃度較高的位置與光學顯微鏡中細胞所在位置重合，而在沒有細胞的位置，Mg和Au元素濃度很低。因此可以確定，Mg和Au的元素信號分別來自于細胞本身和進入細胞的金納米顆粒。 
　　為了準確得到單個細胞中的元素含量，需要發展合適的定量標準和校正方法。Wang等使用微噴系統制備了與細胞大小和含碳量相似的標準液滴，作為基體匹配的單細胞定量標準，成功實現LAICPMS定量分析單細胞中的金屬納米顆粒[21＼]。此外，現有的激光器最小光斑約為5μm，如果希望用LAICPMS技術得到單個細胞中的元素成像圖，則需要進一步提高空間分辨率。Becker等提出的近場剝蝕技術，將LAICPMS空間分辨率提高到亞微米級，有望真正實現單個細胞成像分析[22＼]。 
　　4結論 
　　本研究建立了LAICPMS元素成像方法，得到了鼠腦切片、單細胞等不同水平生物樣品的元素成像圖。LAICPMS由于具有空間分辨率高、檢出限低、運行成本較低等優勢，有望作為其它生物成像技術的有力補充，在生物醫學研究中得到更廣泛的應用，發揮更重要的作用。