基因工程角蛋白酶的研究

以往對角蛋白酶的研究工作主要集中于菌種篩選、酶的提取純化和活力測定等基礎工作，對酶結構和基因表達的研究極少。20世紀90年代，隨著分子生物學技術的發展，國外的一些學者開始進行角蛋白酶基因工程表達和分子結構等方面的研究。Lin X等采用隨機引物PCR的方法獲得了編碼地衣芽孢桿菌PWD-1菌株分泌的角蛋白酶基因（Ker A）的全序列，Ker A基因與地衣芽孢桿菌NCIMB6816編碼Carlsberg枯草桿菌蛋白酶的基因具有97％的同源序列。

將Ker A基因轉染產酶缺陷型枯草桿菌DB104菌株，該轉化菌株能在含羽毛的培養基和LB培養基中產生活性角蛋白酶[14～16]。Woodfolk JA等從紅色毛癬菌cDNA文庫克隆了Tri r4，并在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達了重組蛋白Tri r4，一個含726個氨基酸的蛋白質，屬絲氨酸蛋白酶家族。

另外，還在埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）菌株BL21中表達和發現了Tri r2，一種毛癬菌的新抗原，編碼412個氨基酸，屬D類枯草桿菌蛋白酶亞家族；通過SYBYL分子模建軟件包進行分子模建，明確了Tri r2的三維分子結構和免疫優勢T細胞抗原決定簇的分子位點[9,17，18]。

2002年，Descamps F等[19]成功地從犬小孢子菌中獲得了3個具有角蛋白水解活性的枯草桿菌蛋白酶的基因全序列，并通過畢赤酵母系統重組表達了SUB3角蛋白酶[6]。Wang JJ 等[20]用枯草桿菌表達系統和埃希氏大腸桿菌系統表達了角蛋白酶—鏈親和素融合蛋白，并用生物素—親和素一步法純化了融合蛋白，提高了純化效率和角蛋白酶的穩定性。上述研究為角蛋白酶的工業化生產與應用提供了良好的工作基礎。由于微生物在底物誘導狀態下表達角蛋白酶，而在非底物誘導狀態下不表達角蛋白酶，因此，差異PCR等方法不失為發現角蛋白酶新基因的良好手段。