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  • 發布時間:2020-09-07 15:07 原文鏈接: 基因擴增檢驗標本的處理保存及核酸提取方法(1)

    應用聚合酶鏈反應(PCR)技術測定臨床標本中的病原體核酸成分,是一種高度敏感,且最為直接的檢測手段。由于臨床標本中含有蛋白質、脂類等物質,可干擾PCR反應,故在做PCR反應前必須進行核酸提取。

    經典的核酸提取方法通常是加去污劑(SDS等)裂解細胞,經蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。

    由于樣本的處理及保存對 DNA和RNA(尤其是RNA)的影響較大,因此在核酸測定時標本的處理及適當保存對測定結果的準確有效非常重要。

    臨床常見的標本有血清(漿)、全血、分泌物、棉拭子、膿液、體液、新鮮組織、石蠟切片等,這些臨床標本的處理和保存方法各有不同。

    臨床標本的處理

    血清(漿)標本

    一些病原體,如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等的PCR檢測常采用血清或血漿標本。

    HBV:標本通常由醫護人員采集,應注意避免溶血,如為血漿標本注意抗凝劑的選 擇,一般用EDTA-Na2或枸櫞酸納,不可使用肝素。標本為全血時,及時分離出血漿,提取病毒DNA進行檢測。



    HCV:檢測RNA病毒。由于RNA極易降解,標本的制備和保存方式往往可以影響測定結果。若用血漿標本,應使用EDTA抗凝。嚴禁使用肝素,因其對PCR擴增有抑制作用, 且無法在核酸提取過程中去除。抗凝后6小時內分離血漿。如用血清標本,則應盡快(2小時內)分離血清 進行檢測,或-20oC保存。

    全血標本

    通常用來提取外周血單個核細胞核酸:如基因組DNA、線粒體DNA、總RNA等。
    抗凝劑:一般使用EDTA-Na2、枸櫞酸納,不使用肝素。

    前處理:
    1)加適量的紅細胞裂解液(破膜液),裂解全血中的紅細胞。
    2)再加適量的細胞核裂液(破核液),裂解白細胞中的細胞核,使核內DNA 釋放出來。
    3)然后再加SDS(十二烷基硫酸鈉)等去污劑,溶解脂蛋白,解聚核蛋白。

    SDS可與蛋白 質結成復合物,使蛋白質變性沉淀,但SDS在以后的核酸提取過 程中必須除去。

    痰標本
    痰屬于分泌物,臨床上常用作結核桿菌DNA測定樣本,由于痰標本中含大量粘蛋白和雜質,故在核酸提取時,一定要對標本進行前處理,即用4%NaOH液化,去除粘蛋白,然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等經典法提取DNA。
    具體方法:

    用無菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml,

    加入4倍體積4%NaOH,搖勻,室溫下放置30 分鐘左右液化

    取1.5ml EP管,加0.5ml 液化痰液,再加0.5ml 4%NaOH室溫放10分鐘

    12000 rpm,離心15分鐘

    棄上清,加無菌生理鹽水1 ml ,混勻,12000rpm離心5分鐘

    棄上清,沉淀物用于 DNA提取
    棉拭子
    用PCR方法檢測性病病原體時(衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、人乳頭狀瘤病毒等),臨床標本一般為棉拭子。標本取材是關鍵,衣原體等病原體感染上皮細胞,因此取材一定要取到細胞。
    具體方法:
    加1ml無菌生理鹽水,充分震蕩混勻,12000rpm ,離心5分鐘

    用棉拭子取尿道分泌物或宮頸分泌物(由醫護人員采集),置無菌試管或EP管內
    棄上清,沉淀加無菌生理鹽水 1ml,打勻,12000rpm,離心5分鐘

    具體方法:

    加1ml無菌生理鹽水,充分震蕩混勻,12000rpm ,離心5分鐘

    用棉拭子取尿道分泌物或宮頸分泌物(由醫護人員采集),置無菌試管或EP管內

    棄上清,沉淀加無菌生理鹽水1ml,打勻,12000rpm,離心5分鐘

    同上,重復洗滌一次

    棄上清,沉淀即可用于DNA提取

    5.體液
    體液標本,包括胸水、腹水、腦脊液、尿液等,可直接離心,取沉淀物提取核酸。
    血性胸腹水,可使用紅細胞裂解液處理:

    加等體積紅細胞裂解液,震蕩混勻,置5-10分鐘

    10000rpm,離心5分鐘,棄上清

    可根據情況重復2-3次,沉淀物用于DNA提取

    6.膿液

    粘稠膿液:同痰標本處理,先用4%NaOH液化,再離心取沉淀提取DNA。
    水樣膿液:直接離心,沉淀用生理鹽水洗2-3次后用于DNA提取。

    7.組織

    組織有新鮮組織和石蠟切片。
    新鮮組織的處理步驟:
    先用生理鹽水洗二次,然后將其搗碎或剪碎(用眼科剪),加蛋白酶K消化后提取核酸

    石蠟切片用于核酸提取,需先用二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后進行DNA提取。


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