基因敲除技術是20世紀80年代發展起來的，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎干細胞技術基礎上的一種新分子生物學技術。所謂胚胎干細胞（EmbryonicStem cell，ES）是從著床前胚胎（孕3—5天）分離出的內細胞團（Inner cellmass，ICM）細胞，它具有向各種組織細胞分化的多分化潛能，能在體外培養并保留發育的全能性。在體外進行遺傳操作后，將它重新植回小鼠子宮，它能發育成胚胎的各種組織。
而基因同源重組是指當外源DNA片段大且與宿主基因片段同源性強者并互補結合時，結合區的任何部分都有與宿主的相應片段發生交換（即重組）的可能，這種重組稱為同源重組。