基因芯片的制備
以玻璃片或硅片為載體,采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。
熒光標記
在基因組DNA擴增過程中,將帶有Cy3或Cy5熒光素的dUTP或dCTP加入到新合成的DNA鏈,使新合成的DNA鏈帶有熒光標識。
雜交和洗滌
使帶有熒光標記gDNA/cDNA與基因芯片上的探針進行特異性互補結合的過程稱為雜交。
基因芯片掃描(microarray scanning)將雜交后的基因芯片置于芯片掃描儀內獲得不同探針雜交信號強度的全貌圖。
基因芯片數據分析
釆用圖像分析軟件對芯片圖像進行分析,將圖像信號轉化為數字信號,對芯片上的數據釆用局部加權回歸散點平滑法(locally weighted scatter plot smoothing,LOWESS或LOESS)進行歸一化,根據Cy3或Cy5信號強度和比值判斷差異基因。
采用實時熒光定量PCR對差異表達基因定量,驗證差異表達基因。