實驗步驟
構建重組基因載體
絕大多數的基因敲除策略都是基于同源重組的機制，其基因載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標記基因等非同源序列，其中同源序列是影響同源重組效率的關鍵因素。
用電穿孔顯微注射方法
把重組DNA轉入受體細胞（一般是胚胎干細胞）核內。
同源重組
基因重組時以載體的同源序列取代染色體靶位序列，實現載體DNA同源目的序列與染色體靶位點的同源重組。
篩選
用選擇培養基篩選已擊中的細胞。
表現型研究研究
將擊中細胞轉移入胚胎使其生長成為轉基因動物，對轉基因動物進行形態觀察及分子生物學檢測。
RNAi引起
RNAi引起的基因敲除：由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中，所以RNAi的反應過程也可以用于基因敲除。