引言
β淀粉樣肽(Aβ)的不溶性聚集物在腦中沉積/形成被看作為早老性癡呆病(AD)的一個關鍵事件。治療策略集中于用以減少β淀粉樣肽生成或提高其清除水平的小分子抑制劑或免疫療法。因此，找到能對腦脊液中的淀粉樣肽進行高靈敏且穩定可靠的定量分析方法以確定其與AD關系對很多研究者來說至關重要。然而，對這些Aβ肽的分析極具挑戰性，這不僅因為其在生物液體內的豐度相對偏低，而且也因為它們可能被其它蛋白質結合并具有形成低聚體的趨勢。
這些肽的測定常規采用免疫測定法(因其選擇性和靈敏度)或者通過冗長的免疫沉淀之后再進行SPE。免疫測定所需的方法開發時間比LC/MS/MS方法開發時間長;它們需要對多種Aβ肽進行多次測定，并且與LC /MS/MS相比其線性動態范圍有限。免疫測定存在交叉反應性和非特異性結合，需要使用價格昂貴的抗體，并且樣品/標本的富集依賴于抗體的選擇性。免疫測定的勞動強度大，并且測定不準確和基質干擾也是常見的問題。因此，需要開發一種基于LC/MS/MS的高通量、選擇性好的生物分析方法，使樣品制備能夠實現在存在高濃度干擾蛋白和肽的情況下回收得到pg/mL水平的淀粉樣肽。
雖然開發免疫測定方法所需的時間在后期藥物發展過程中是可接受的，但在較早的階段中則幾乎不切實際;這時，如能有一種可定量多種肽的高通量且可靠的方法則是眾望所歸。
本研究工作集中于開發用于淀粉樣前體蛋白(APP)的1-38、1-40和1-42片段的LC、MS和選擇性SPE樣品制備方法，以支持臨床前研究。使用單一、高通量方法用于多種Aβ肽的分析測定而無需耗時的免疫沉淀步驟，被成功開發并經過驗證。特別是，Aβ類肽存在很多獨特的分析挑戰，其中包括非特異性結合、溶解性差、聚集和質譜靈敏度偏低。在方法開發各階段所進行的步驟盡可能減小或消除了這些問題所帶來的影響。
隨著AD病情緩解策略的出現，對除了Aβ 38、40和42之外的多種可能與AD病征相關的Aβ進行定量分析可有助于提供關于此病及其發展過程的更多認識。本文所述的方法也有可能進行相應的修改，以使其適用于那些肽的定量分析。
β淀粉樣1-38肽，分子量4132，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG β淀粉樣1-40肽，分子量4330，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV β淀粉樣1-42肽，分子量4516，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 圖1：β淀粉樣肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI數據
實驗 UPLC?方法的條件 色譜柱：
ACQUITY UPLC? BEH C18，300?，2.1×150nm，1.7μm 流動相： A：0.3% NH4OH(按體積計算)的水溶液 B：90%乙腈，10%流動相A 梯度： 90% A保持1分鐘，5.5分鐘內降低至55% A并保持0.2分鐘，然后返回至初始水平 流速： 0.2 mL/分鐘 進樣量： 10μL 溫度： 50℃
質譜條件 系統：沃特世XevoTM TQ三重四極桿質譜儀，在ESI+MRM模式下運行 去溶劑化氣體流速：800L/小時 源溫度：120℃ 去溶劑化溫度：450℃ 碰撞室壓力：2.6×10(-3)毫巴 MRM躍遷態和條件：見表1
樣品預處理
用5M鹽酸胍以1:1的比例稀釋200μL腦脊液(人腦脊液、猴腦脊液或加標人工腦脊液+5%大鼠血漿)，并在室溫下振搖45分鐘。然后，用200μL 的4%H3PO4水溶液進一步稀釋樣品。 注意：對于加標樣品而言，在加標后、用鹽酸胍稀釋前，可在室溫下讓樣品平衡30分鐘。
固相萃取(SPE) 基于μElution 96孔型的Oasis? MCX 預處理：200μL甲醇 平衡：200μL 4% H3PO4水溶液 上樣：600μL預處理后的樣品 清洗1：200μL 4% H3PO4水溶液 清洗2：10% ACN水溶液 洗脫：2×25μL 75:15:10 ACN:水:NH4OH濃溶液 稀釋：25μL水 進樣量：20μL
| 肽名稱 | 前體離子 | 產物離子 | 產物離子ID | 錐孔電壓（V） | 碰撞能量（eV） |
| β淀粉樣1-38肽 | 1033.5 | 1000.3 | b 36 | 33 | 23 |
| β淀粉樣1-38肽的N15內標 | 1046 | 1012.5 | 30 | 22 | |
| β淀粉樣1-40肽 | 1083 | 1053.6 | b 39 | 33 | 25 |
| β淀粉樣1-40肽的N15內標 | 1096 | 1066.5 | 35 | 22 | |
| β淀粉樣1-42肽 | 1129 | 1078.5 | b 40 | 28 | 30 |
| β淀粉樣1-42肽的N15內標 | 1142.5 | 1091.5 | 35 | 28 |
表1：β淀粉樣肽及其N15標記型內標的MRM躍遷態和質譜條件
結果和討論 開發這些方法所遇到的最大挑戰就是克服溶解性、吸附性和聚集性問題并獲得能滿足該應用要求的足夠選擇性和靈敏度。適當的流動相和進樣溶劑構成以及明智選擇SPE洗脫溶劑僅僅是應對這些問題的幾個關鍵因素。