實驗材料 大腸桿菌菌株色氨酸類似物寡核苷酸引物
試劑、試劑盒 結合緩沖液清洗緩沖液洗脫緩沖液
儀器、耗材 Luria-Bartani 培養基Microcon 濃縮器
實驗步驟
下述方法包括：
( 1 ) 大腸桿菌在色氨酸類似物中的生長。
( 2 ) 含 fW 取代氨基酸的蛋白質的表達和純化。
( 3 ) 對非天然氨基酸進行深入水平的分析。
3.1 大腸桿菌在非天然氨基酸（培養基）上的生長
色氨酸類似物摻入大腸桿菌是直截了當的。因為色氨酰轉移 RNA 合成酶沒有編輯結構域，天然氨基酸與類似物的區分只是在結構上。枯草桿菌色氨酰轉移 RNA 合成酶可以相對更有效地結合（裝載）熒光化的色氨酸類似物；4 fW 的結合比 W 低 6 倍，而 5fW 的結合比 W 低 74 倍 [ 13 ]。與此類似，已經知道色氨酸類似物進入細胞，并在類似物的毒性起作用之前支持最少幾代的生長。為了使色氨酸類似物有效摻入，使用帶有防止生物合成的突變細菌菌株（見注 2；參考文獻 [ 4~6 ]，[ 9 ] 和 [ 11 ])。在本節介紹的例子中，使用了大腸桿菌菌株 C600 及其衍生菌株。基本培養基中補充了蘇氨酸、亮氨酸、硫胺以及色氨酸類似物，或某些比例的非天然對天然氨基酸。習慣上，培養基是用補充成分命名的。例如，M9B1TL 95% 4 fW + Ap 補充了維生素 B1 ( 硫胺）、蘇氨酸、亮氨酸、19：1 的 4fW : W 和 Ap。
非天然氨基酸摻入對細菌生長能力的影響可通過分析生長曲線來確定。ELX808 微板閱讀器 [ 14 ] 或 Bioscreen C [5] 這樣的儀器可以并行地獲得多條微板格式的生長曲線。在用 Bioscreen C 的測試中，C600p 在基本培養基中的過夜培養液稀釋 100 倍后，接種到每種 1.5 ml 的測試培養基中，以測試對生長的抑制。將這些 1.5 ml 的培養基按 350 μl 分到 3 個小坑中。于 37°C 不停地搖動，直到所有培養物均進入穩定生長期。把生長曲線的指數部分擬合到方程：
式中，f 為時間；N 為時刻 t 的菌體數（或光密度）；N0 是初始的菌體數，可以算出菌體固有的生長速率 r。例如，在生長曲線的指數部分擬合到式（2.1 ) 以后，在對 W 的比率在 97% 以下時，4fW 很少引起生長速率的改變，而 5fW 和 6fW 的影響要激烈得多（圖 2.1)。因此，作為細菌的常規生長，比率 19 : 1.4 fW : W 可以在培養基中使用。如果培養基只提供 4fW 的話，大腸桿菌可以連續幾代生長。而且，通過擬合整條曲線（與僅擬合指數期相反）到對數生長方程，可以達到對生長曲線的更完全理解。這個對數生長方程考慮了承載能力：
式中，除了培養物的承載能力 K 以外，其他變量與式（2.1 ) 相同。這個方程已用于在氨酰化錯誤條件下大腸桿菌氨基酸類似物摻入效果的定量化 [15] 。
3.2 摻入 4fW 的蛋白質的表達和純化
本節描述建立兩個表達質粒（見 3.2.1.1 和 3.2.1.2 ) 以及在 W 替換為 4fW 的高置換率條件下蛋白質表達和純化的步驟（見 3.2.2.1 和 3.2.2.2 )。用表達和純化的語言，在氨基酸類似物上的生長所需要的工藝變動，與只在天然氨基酸上的生長略有關系。最后，這一節將對從已摻入非天然氨基酸的細菌中分離胞內總蛋白的方法給一個 概述。
3.2.1 表達載體的構建
1 ) pGSR
由于 C600p 中的 pUC18 質粒 pGEX-KG [ —種谷胱甘肽-S-轉移酶（GST )表達載體] 需要 Ap 以外的選擇方法，因而，用 SmaI 和 EcoRI 降解質粒。P182Sfi-Kan 的 Kn 激酶基因由引物 Kan 1.39 ( 5'-CGCGGATCCGGCCACCATGGCCAAGCGAACCGGAAT) 和 Kan2.39 ( 5 LCCGGAATTCTGAGGCCTGACAGGCCTTAGAAGAACTCGT ) 用 PCR 擴增。PCR 產物用 BsaBI 和 EcoRI 降解并連接到 Smal 和 EcoRI 降解后的質粒 pGEX-KG 上 [16]，然后轉化到 DH5F' 中，再用微量制備分離（ QIAgen) 。得到的質粒 pGSR 是一種帶有 Kn 抗性的 GST 表達載體。
2) pET100GFPuv
高熒光的 GFPnv 的基因從質粒 pGFPuv 用 Vent DNA 聚合酶（NEB) 以引物 CFPA (5，-CACCACGGCCACTGTGGCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-3’）和 CFPB ( 5 ,- GGCCATCGGGGCCCTATTTTATAGTTCATCCATGCC-3' ) 通過 PCR 擴增；拓撲異構酶介導的定向克隆需要在正向引物中的 5'-CACC 片段。通過 7.5 μl PCR 產物與 1 μl 的 10X 緩沖液、1 μl 的 4 mmol dNTP 和 0.5 μl 的 Tag DNA 聚合酶在 72°C 保育 20 min，把突出的腺苷殘基加在擴增產物上。按制造者的指示，這個反應用來克隆 GFPuv 基因到 pET100/D-topo 中。拓撲異構酶反應是用來轉化化學上具競爭性的 TOP10 細胞。得到的質粒用微制備（QIAgen) 分離。PET100GFPuv 帶有 Ap 抗性并且在 T7 核酸（RNA ) 聚合酶啟動子的控制下，需要在攜帶 λDE3 溶源體的寄主菌株中表達 GFPuv。
3.2.2 蛋白質表達和純化
為了實現非天然氨基酸的高水平摻入，初期的生長是在比較寬松的條件下進行的，然后轉變到包含誘導子的更具限制性的條件下 [5] 。這一目的也可以通過提供有限數量的容許氨基酸和過量的非天然氨基酸來實現。當天然氨基酸耗盡時，這些非天然氨基酸就會得到利用（見注 3 和參考文獻 [17 ])。
1）高摻入 4fW 的 GST 的表達和純化
( 1 ) 在 M9B1TL 95% 4 fW + Kn 中，過夜生長的用 pGSR 轉化的并在 Kn 板上選擇的 C600p 的一單菌斑。
( 2 ) 把第一步的初始培養稀釋 100 倍接種于 100 ml 同樣基質的培養液中。把細菌培養到中指數期（mid - log ) ( 在 600 nm 處，光密度 0.5 )。
( 3 ) 以 5400 g 離心培養液 20 min，并懸浮在補充了 0.3 mmol/L IPTG 的 100 ml M9B1TL 3 X 100% 4fW + Kn 中，繼續培養 16 h ( 見注 4) 。
( 4 ) 如步驟 3 將細胞離心，再用 5 ml B-PER ( Novagen ) 試劑裂解。
( 5 ) 離心去除不溶解部分之后，加入 10 mmol/L 氯化鎂（ 從 1 mol 儲備液中取）和 5U DNA 酶，常溫保育 15 min。
( 6 ) 加入 500 μl 50% 谷胱甘肽瓊脂糖凝膠球珠漿到裂解液中，并在常溫下用攪拌機混合 2 min [18] 。
( 7 ) 以最高速度簡單離心球珠。加入 5 ml PBS 沖洗球珠。再重復沖洗 2 次。
( 8 ) 用 1 ml 冰冷的 PBS 做最后的沖洗，再移到微離心管中。
( 9 ) 在室溫下用 50 mmol/L Tris-氯化氫，pH 8.0，外加 5 mmol/L 還原的谷胱甘肽。在室溫下旋轉 2 min 以從球珠上洗脫純化的 GST，分 3 次進行，每次 0.5 ml。
( 10 ) 用 M icrocon 濃縮器濃縮這 3 份樣品。
( 11 ) 用 SDS-PAGE 測定蛋白質純度；純度應高于 95%。
2 ) 摻入 6fW 的 GFPuv 的表達和純化
( 1 ) 在 200 ml 的 M9B1TL W + Kn + Ap 中生長的 C600F ( DE3 ) 中加入 pET100GFPuv。
( 2 ) 在中指數期，離心培養并使得到的細胞小團重新懸浮在 100 ml 含 1 mmol/L IPTG 的 M9B1TL 95% 6 fW + Kn + Ap 中再繼續生長 3 h ( 見注 4 ) 。
( 3 ) 在終止培養并用 3 ml B-PER 裂解細胞小團。以 15000 g 離心 30 min 以清除不溶物。在上清液中加入 10 mmol/L 氯化鎂（從 1 mol 儲備液中取）并加入 3U DNA 酶，在室溫保育 10 min。
( 4 ) 準備 3 ml Ni-NTA 柱，用 15 ml 水和 9 ml 結合緩沖液沖洗。
( 5 ) 讓上清液通過 Ni-NTA 柱。用 30 ml 結合緩沖液和 18 ml 沖洗緩沖液沖洗，再用 18 ml 洗脫緩沖液洗脫。從柱上逐份搜集洗脫液，每份 0.5 ml，用 SDS-PAGE 和用紫外光照射分析（含有蛋白質的樣品可見熒光）。濃縮含蛋白質的樣品如 2.3. 2.2 中 1 ) 所述。
3.2.3 細胞全蛋白抽提物的純化
用于 4fW 的摻入：
( 1 ) 在 25 ml 恰當的基質中生長 C600p 到飽和；
( 2 ) 離心培養液其變為液滴，并在 200 μl B-PER 中裂解；
( 3 ) 讓 50 μl 裂解液通過 Centri-Sep 尺寸排斥柱以去掉未摻入的氨基酸。
類似地，用于分析細菌對 6fW 的鑒別：
( 1 ) 在 100 μl M9B1TL W + Kn 培養基或 M9B1TL 95% 6fW + Kn 培養基中，使生長的 C600F 達到飽和；
( 2 ) 使細菌聚集成顆粒狀并在 200 μl B-PER 中裂解；
( 3 ) 半體積的裂解液通過 Centri-Sep 柱 [ 見 2.3.3.1 中 1) ] 。
3.3 非天然氨基酸摻入程度分析
本節討論了確定非天然氨基酸摻入水平的兩種方法。完全水解然后用 HPLC 和質譜分析 [ 見 2.3.3.1 中 1 ) ] ，或 者 HPLC 分析之后在不同的條件下再用 HPLC 分析 [ 見 2. 3. 3.1 中 2 ) ] ，可以用來純化蛋白質和全細胞蛋白抽提。但是，蛋白質酶解和片段分析（見 2.3.3.2 ) 只 能用來純化蛋白質。
3.3.1 純化蛋白的分析
表 2.1 列舉了應用 2.3.3.1 中 1 ) 和 2.3.3.1 中 2 ) 兩個小節所述方法的例子。
1 ) 含非天然氨基酸蛋白的水解和 HPLC-ESI 分析
蛋白質樣品的酸水解可以確定蛋白質的成分。不管是全細胞蛋白抽提物或純化的蛋白質，都要經過整體平均化。
( 1 ) 凍干蛋白樣品（如 2.3.2.3 中從 Centri-Sep 柱出來的半量洗脫液，2.3. 2.2 中幾毫克純化蛋白）。
( 2 ) 將團體物質重懸在 1 ml 含 10% 巰基乙酸的 5.4 mol/L 氯化氫中以在水解中保護色氨酸。
( 3 ) 在真空和 110°C 下水解過夜。
( 4 ) 凍干水解產物，并重懸在 50 μl 的水中。
水解產物可用 HPLC-ESI 分析。在這種情況下，當從 HPLC 柱上洗脫時，天然的和非天然的氨基酸的比質量可被測定和跟蹤。洗脫質量的相對比率可用曲線下的面積確定。氨基酸的實際摩爾數可用標準曲線確定。
2 ) 水解蛋白樣品的 HPLC-HPLC 分析
另一種辦法是完成一系列的 HPLC 分析。
( 1 ) 把水解試劑注入 C-18 柱并用下列步驟洗脫。
a. 用 94% 緩沖液 A 和 6% 緩沖液 B 洗脫 20 min。
b. 10 min 內用梯度法切換到 98% 緩沖液 A 和 2% 緩沖液 B。
c. 再洗脫 15 min。
d. 在最后 5 min 將柱子重新平衡到 94% 緩沖液 A 和 6% 緩沖液 B。
( 2 ) 收集對應于標準峰（如 W 和 6fW ) 的洗脫液并凍干，再重懸在水中。
( 3 ) 把樣品重新注入同一個柱中，但緩沖液改為 80% 緩沖液 C 和 20% 緩沖液 D。不同分子的同時洗脫可能發生在一組緩沖液條件下，但不大可能發生在兩組緩沖液的條件下。在第二個緩沖條件下的曲線下面積可以認為是純樣品，并可以比較對應于天然的和非天然的峰面積。
在有色氨酸和色氨酸類似物的情形下，280 nm 處探測，不需要衍生化（見注 5)。苯丙氨酸和酪氨酸在純化的蛋白質中顯示小的吸收峰，而全細胞蛋白的抽提物會產生大量的小峰。盡管如此，定量的數據仍可得到。
3.3.2 蛋白酶降解以確定非天然氨基酸摻入水平
由于特定多肽片段的質量可以基于蛋白質序列預測，預測片段的質量位移有可能是由于特定非天然氨基酸摻入的結果。因而，分析蛋白酶降解產物就是確定氨基酸類似物摻入的敏感方法 [ 5，19，20] 。
( 1 ) 凍干純化的 GST [ 如 5 μg，見 2.3.2.2 中 1 ) ] 并重懸在 0.1 mol/L 乙碳酸氫銨中。
( 2 ) 在 37°C 用被固定化的 L-甲苯磺酰胺-2- 苯乙基氯甲基酮處理過的胰蛋白酶 (Pierce) 降解 10 h。
( 3 ) 離心以去除胰蛋白酶（見注 6 )。
( 4 ) 凍干降解物，并在水中重懸至 210 μmol/L。
( 5 ) 用 HPLC-ESI 分析降解產物。
可以跟蹤特定質量的洗脫剖面，并證明非天然氨基酸在特定片段中的摻入水平（圖 2.2 )。