大腸桿菌細胞的破碎和包涵體的制備實驗

過表達σ32 的大腸桿菌細胞株

氯霉素 氨芐青霉素 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 利福平 LB 培養基 SDS 樣品緩沖液 脫氧膽酸鈉

Oak Ridge 離心管 帶刻度的聚丙烯錐形離心管 Tissue-TearorTM 勻漿器 超聲破碎器

材料與設備

過表達σ³² 的大腸桿菌細胞株〔BL21(DE3)/pLysS,pLHN16〕

氯霉素

氨芐青霉素

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)

利福平

Oak Ridge 離心管（40-ml)

帶刻度的聚丙烯錐形離心管（50-ml)

Tissue-Tearor^TM 勻漿器（Fisher Scientific15-338-55)

超聲破碎器

試劑

LB 培養基

SDS 樣品緩沖液（2X)

脫氧膽酸鈉（DOC)(20% 儲液)

(配方，見"試劑的配制"，PP.184~189)

操作程序

原材料的制備

本單元所用的大腸桿菌細胞株〔σ³² 的過表達質粒為 pLHN16, 宿主菌為 BL21(DE3)/pLysS〕是按 Nguyen 等（1993) 所述方法構建的〔參見 Nuvagen 公同出版的 pETTM System Manual(Novagen,Inc.1995) 中關于 pETll 表達系統的應用〕。

1) 大腸桿菌于 37°C 搖瓶培養，搖瓶體積為 2000-ml，每瓶裝 500 ml LB 培養基，在氯霉素（25ug/ml)/氰芐青霉素（100ug/ml) 的選擇壓力下，培養至 A_550nm 達 0.9。

2) 加 IPTG, 至終濃度為 1 mmol/L, 誘導 T7RNA 聚合酶表達。誘導 0.5 h 后，加利福平至終濃度為 150ug/ml, 以獲得最大程度的過表達。

3) 加利福平后 3.5 小時結束培養，4°C、8000r/min 離心 30 min, 收集細胞。將毎升培養液所得的細胞沉淀物重懸于 30 ml LB 培養基，再用 40-ml Oak Ridge 離心管，4°C、13000r/min 離心 10 min。細胞用干冰速凍，儲存于-70°C 備用。
注：本單元所用的細胞雖是凍存的，但對于未知的蛋白質，用新鮮細胞制備要安全得多，特別是需要重折疊的話。細胞凍存最好不超過 5d(天）。

為監測純化操作步驟的取樣

為監測純化的進程和效果，有必要在每個純化階段對每個組分進行下列操作步驟。

1) 測量體積。
注：一個非常便捷的辦法是，對所用的各種大小的試管例如：Eppentbrf 管、Oak Ridge 離心管等，細心地加 H₂O 并標出各體積所對應的水平線，準備好一套經過標定的管子，以用來快速測量溶液的體積。帶刻度的錐形離心管也可方便地用于這一目的。

2) 將一份 36-ul 的樣品加入 84ul SDS 樣品緩沖液 (2X) 中，70~90°C 水浴加熱 2~5 min, 保存于 4°C 。

3) 留取部分樣品（150ul) 供蛋白測定和免疫定量（inrnumo-quantitation) 用。將上述信息記錄在純化記錄表中，并以此編制純化總結表。必須小心地留存好有代表性的樣品。這就是說，應在臨取樣前將整個組分真正混合均勻。這一點對那些含有沉淀或重懸的不溶物質的組分來說尤為重要。為方便起見，在留取用于 SDS 凝膠電泳分析和蛋白質定量測定的樣品時，可造一張表，列出樣品A~J 及其有關描述和體積，以及要檢査的兩種層析柱。在本單元中，還將指導你在不同的純化階段進行取樣（如各實驗中所述)，這些樣品將用于純化方案的補充實驗，如本單元最后一節所述。

超聲破碎細胞

1) 取 3 g 大腸桿菌細胞 [BL21(DE3)/PLysS，pLHN16〕于室溫下解凍。細胞經組織破碎器短暫勻漿后，重懸于 20 ml 緩沖液 A(置一 40-ml 的 Oak Ridge 離心管) 中。
注：純化σ³² 時，緩沖液 A 中不加還原劑，因σ³² 不含半胱氨酸殘基。通常，所有緩沖液中都要加 (0.1~0.5 mmol/L 二硫蘇糖醇，以防蛋白質氧化。

2) 用大超聲頭，設定 8 個循環和 50% 的時間間隔，在冰浴中超聲 90s。
注：BL21 DE3 細胞攜帶有表達 T7 溶菌繭的 pLysS。不過，該溶菌酶不能從內側攻擊細胞壁，故此基因不是致死的。當細胞凍融時，溶菌醅會接近細胞壁，使細胞裂解。在有些情況下，這足以使細胞破裂，但必須解決好因 DNA 釋出而產生的粘度問題。一種方法是用相當大量的 DNA 酶 I 消化，但這可能是昂貴的，并對混合物又加入了一種蛋白質，因而可能引起更多的麻煩（例如，正在純化 DNA 結合蛋白的話)。為此，為確保細胞完全玻碎，我們采用了超聲處理法。這可在很大程度上切斷 DNA, 使包涵體的沉淀變得較為容易。

3) 加 DOC, 使終濃度為 0.2%(即，加約 240ul 的 20%DOC 儲液)。混勻，靜置 10 min
注：1. 0.2%DOC 是用來幫助釋出少量不溶性蛋白質的，在高濃度（2.0%) 下則釋出細胞膜的成分（見實驗 2)。DOC 溶解得相當慢，因此，其儲液應提前 1 天配制。2. 若只想分離包涵體. 不希望對上清中的可溶性蛋白質作進一步的分級分離（如下文的樣品 B), 則可在這一步加 DOC 至終濃度 2%, 并略去實驗 2 中所述的第二次 DOC 洗滌。

4) 取第一個樣品（樣品 A), 如上所述見 p.146)。

包涵體和可溶性提取物的制備

1) 為沉淀包涵體，細胞裂解物用小轉頭（SorvallSS-34 或 Beckman JA20),4°C、13000r/min 離心 10 min。

2) 輕輕傾出上清（取樣品 B)，冰上保存，供 PEI 沉淀和免疫親和層析（IAC) 純化核心 RNA 聚合酶-P2 復合物用（見實驗 3)。關于包涵體中的過表達的溶解和復性，見實驗 2。