如何正確地認識和使用酶標儀

正確地認識和使用酶標儀

作為微孔板比色計的酶標儀，其基本功能不外乎一個比色測定，所不同的是在測定波長范圍、吸光度范圍、光學系統、檢測速度、震板功能、溫度控制、定性和定量測定軟件功能等方面的差異，當然全自動酶免疫分析系統還具有自動洗板、溫育、加樣等功能。在臨床實驗室實際工作中，實驗人員在使用酶標儀進行測定操作時，有時難免會對酶標儀的一些性能指標產生迷惑，甚至對酶標儀的應用產生錯誤的理解。如諸如使用酶標儀較用肉眼觀察測定的陽性率明顯增加這樣的問題。
一、測定波長 一般酶標儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，完全可以滿足ELISA的顯色測定。目前國內常見的ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶（HRP），底物通常為四甲基聯苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD），其在過氧化氫溶液的存在下，經HRP作用，分別氧化為2，2，—二氨基偶氮苯（DAB）和聯苯醌。當pH值為5．0左右時，DAB在450nm波長處有zui大吸收，當pH值降為L 0時，zui大吸收波長移至492 nm，同時摩爾消光系數變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。TMB的氧化產物聯苯醌在波長450nm處有zui大消光系數，如果HRP量少，H：O：和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉變為黃色的聯苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產物穩定90min。因此，450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定zui常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉換的部件，可以同時安裝6～8片濾光片，所配備的濾光片均應包括上述兩個波長，有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。除了這兩個基本濾光片外，考慮到雙波長比色的需要，還應有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可根據自己的需要選擇。有時，有的實驗室希望用酶標儀作微量生化測定，故酶標儀生產廠家對其生產的酶標儀擴展了紫外檢測功能，此時需要一個340 nm波長濾光片。此時，酶標儀的測定波長范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標儀有單波長和雙波長檢測功能有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具zui大吸收的波長即450 nm或492 nm進行比色測定；而“雙波長”則除了用對顯色具zui大吸收的波長即450 nm或492 nm進行比色測定外，同時用對特異顯色不敏感的波長如630 nm進行測定，酶標儀zui后打印出來的吸光度則為二者之差。630 nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板孑L上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，使用雙波長，且不必設空白孔。
二、測定的吸光度范圍 通常，酶標儀的吸光度測定范圍在。一2．5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標儀可測定的吸光度一般在。一2．5之間，但現在基本上都做了拓寬，可達到3．5以上，并且能保持很好的精密度與線性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK—2的吸光度測定范圍為0—3．5，而Multiskan Ascent的吸光度測定范圍（Abs）達0～4．0，在0～4．0范圍，線性誤差不超過±2．0％，在0．3—3．0吸光度范圍內，測定精密度CV小于±0．2％；3．0～4．0Abs范圍內，測定精密度CV小于士0．2％。因此，對于酶標儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要要看在一定的吸光度范圍內的線性和精密度如何。
三、光學系統 酶標儀的光學系統采用的是垂直光路多通道（通常為8或12通道，亦有單通道）檢測，一般為硅光管或光導纖維，除測定通道外，有的酶標儀還有一個參比通道，每次測定可進行自我校準。酶標儀的光學系統功能如何，均可通過酶標儀測定的吸光度范圍、線性度、精密度和準確度等體現出來。光學系統好的話，則上述指標也應較佳。測定的精密度與測定通道之間的均一性有直接關系。單通道可避免因通道不同所致的差異。
四、檢測速度 酶標儀的檢測速度是指其完成比色測定所需要的時間。檢測速度快，有利于提高檢測的精密度，即避免由于測定過程中，因測定時間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。目前市場上常見的酶標儀檢測速度都非常快，通常在數秒鐘內，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK—3檢測96孔只需2s（連續模式）或5s（步進模式）。Multiskan Ascent為單通道檢測，亦只需9s（連續模式）或14s（步進模式）。又如BioRad公司的Benchmark的檢測速度單波長為7s，雙波長為15s。
五、震板功能 酶標儀的震板功能是指酶標儀在對ELISA板孔進行比色測定前對其進行振蕩混勻，使板孔內顏色均一。目前市場上常見的酶標儀均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉等方式及振蕩幅度等任意調節，如Labsystems的MK-2；有的則較為固定，如BioRad 550。使用有震板功能的酶標儀，在進行ELISA測定顯色反應完成加入終止劑后，可不必振蕩混勻，直接放人酶標儀上測定即可。
六、溫育功能 溫育功能是指酶標儀本身能按要求自動地控制儀器內部的溫度，使得ELISA測定中微孔板條的溫育過程可在儀器內部完成，而無需再外配溫箱。目前，只有少部分酶標儀具有此種功能，如Labsystems公司的Multiskan Ascent，BioRad公司的Benchmark和Biotek公司的ElxS08等。溫育功能只是酶標儀的一個附加功能，是否具有并不能說明酶標儀檔次的高低及儀器的優劣。作為實驗室是否選擇，則可根據自己實驗室的條件及需要來決定。
七、軟件功能 軟件功能是指酶標儀所具有的對ELISA定性和定量測定及其他測定方式如酶標動力學、紫外和凝集等數據的統計分析并報告結果的功能。軟件功能是中酶標儀的一個非常重要的功能。如果硬件方面區別不大，則軟件就成為判定酶標儀優劣的惟一指標。對于用戶來說，好的軟件功能，對實際工作會有較大的幫助。ELISA定性測定，酶標儀如具有陽性判斷值（cut-off）及其測定“灰區”（即指測定吸光度處于cut—off周圍的一定區域，此區域內結果應為“可疑”）的統計計算功能，不但方便了實驗室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實用價值。如血站實驗室為篩檢獻血員血進行HBsAg、抗HCV和抗HIV等的ELISA測定時，常會遇到測定吸光度處于cut-off附近但又低于cut—off的血，按照試劑盒的標準，可判為陰性，血為合格血，可用于患者輸血，但直覺告訴我們，這樣的血如輸給患者，導致輸血后相應疾病發生的可能性較大，這是由ELISA現有的測定技術的不確定性所造成的，也就是ELISA測定的“灰區”的存在使得ELISA測定試劑盒cut-off的設定只是相對的準確，此時的假陽性和假陰性出現的可能性較低。因此，在血站篩檢獻血員血時，如以測定“灰區”的下限作為判斷獻血員血篩檢不合格標準，就可以避免因“灰區”所致結果判斷錯誤而引起輸血后疾病發生的可能性。合適的軟件功能對于ELISA定量測定同樣很重要。有研究表明，四參數方程能較好地反映免疫測定的劑量反應曲線，zui為適合于定量酶免疫測定的曲線擬合。因此，如目的是定量測定，則在酶標儀的軟件功能中，要有這種曲線回歸方程計算分析功能。其他諸如連點、直線等回歸計算，則可根據酶標儀的應用目的而定，如兼用于微量生化測定，則此類回歸計算就很有必要。
此外，酶標儀兼做酶標動力學、凝集反應測定所需的軟件是否應具備，當然也應根據使用目的而定。由于此類軟件一般都較為昂貴，酶標儀常另外單獨按需配備，如果不是實驗室特殊需要，就不必強求這種軟件功能。
八、語言界面 通常進口的中酶標儀人機對話多采用英文。這對于某些基層實驗室可能會存在語言方面的困難，從而難以zui大限度地發揮酶標儀的作用。為解決這方面的問題，已有一些酶標儀采用了中文界面，如Labsystems的MK-3。這樣就大大方便了廣大基層實驗室技術人員的使用。
綜上所述，盡管酶標儀的發展極為快速，種類繁多，功能也不斷加強，但其zui根本的功用是不變的，即比色測定。大凡比色測定，其基本要求就是在一定吸光度范圍內要有好的測定準確性、線性和精密性。同樣的吸光度范圍，測定的準確性、線性和精密性越好則酶標儀亦越佳。
而且，由于用于酶標儀比色測定的為多孔（通常為96孔）微孔板條，為保證測定的孔間重復性，則測定速度也是一個較重要的性能指標。至于其他如震板、溫育及有關的軟件功能，則可根據各自實驗室的需要去比較選擇。