實驗分析方法PCR擴增產物

孔板夾心雜交法：
　　該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗后顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡 便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常 規應用的ELISA，適于臨床實驗室常規應用。另一種微孔板雜交法不 是采用夾心法，而是直接將特異探針固定微孔板上，然后用生物素 標記的PCR產物雜交。微孔板雜交與膜印跡雜交相比，有如下優點： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗時間短，節省了檢測時間，因為 膜雜交過程中，反應劑要浸透膜中，漂洗時，使反應劑全部浸出需 要時間較長；③本底低，微孔板雜交不需Dehatdt液和預雜交以及封 閉過程。另外，微孔板固定的DNA不需再加熱或UV照射。
　　微孔板雜交的基本過程包括L：DNA的固定，探針的雜交和酶聯顯色。DNA的固定
　　在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上。不同來源 的微孔板固定DNA時所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）來固定加熱變性的核酸，然后，用固 定濃度的標記探針雜交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度。固定方 法的選擇必須使DNAzui大量的固定，且不影響雜交。用合適濃度的 NaCl或(NH4)2SO4可達到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合 適時，DNA應為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA“平躺”固定在孔內而影響雜交。Mg2+雖有促進DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA應大于300bp， 否則影響雜交結果。每孔可固定高達200ng(624bp)的DNA。合適的鹽 濃和固定量一經確定，可按下法固定DNA。
　　待固定DNA100℃加熱5min變性并立即冷卻。
　　與合適的固定液混合后，加入微孔板的孔內。固定液：10mmol/L磷 酸鈉-10mmol/LEDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合后， 終濃度為zui適固定濃度）。
　　用膠布封好，浸于37℃水浴2h。
　　用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。
　　立即用于雜交，或封閉于塑料袋內保存。
雜交
　　可采用標準的雜交系統雜交。夾心雜交時，是將變性的PCR產物與檢 測探針一并加。雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短。
顯色
　　根據不同酶標檢測分子的不同選擇不同的底物、終止劑和測定波 長。
顏色互補分析法(A)
　　顏色互補分析法是利用三原色原理，當不同DNA 篇段（A和B）同時擴增時，用引 物5’端修飾技術將不同引物用不同顏色熒光素標記（A   篇段引物標記綠色的熒 光素，B標記紅色的羅丹明）。如果僅有一條片段被擴增，擴增產物激發后，只有 一種顏色（紅色或綠色）。如果兩條不同大小的片段均被擴增，可通過電泳分離，紫 外激發后可觀察到不同顏色的兩條帶。如果兩條被擴增片段大小相同，電泳后可見一 條紅綠互補色-黃色帶。如果不用電泳法分離擴增片段，通過一定手段除未摻入引 物，亦可觀察到擴增產物的顏色。此時，擴增產物無論大小，只要均被擴增，就可見 一條紅綠互補的黃色條帶。
　　該法簡便、易于自動化，可用于檢測基因，缺失、染色體轉位和病原微生物。這種情 況下，只需判斷產物的有無。另外，在檢測多種基因實變、多種病原菌和HLA分型 時，可用復合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標記（如綠色的ROX；藍色的COUM 等）。
PCR-ELISA法：(A)
　　本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規ELISA記數儀檢測。因為5’端修飾后仍 可進行常規PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5’端使其攜帶 便于PCR產物固定的功能基團，而通過另一引物5’端的修飾使產物便于檢測。
　　鏈霉親和素的包被：不同廠家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差異并不顯著。親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔內加入100μl，封好，室溫過個夜。 用PBS液漂洗。 
　　擴增產物與包被板的結合：PCR產物1μl用50μ1PBS-Tween液稀釋后加入包被孔內。室溫下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未摻入的熒光引物。　　ELISA：向結合有PCR產物的孔內加入50μlPBS-Tween液稀釋的HRP-抗FITC抗體，室溫下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。 
　　將1mgTMB溶于1ml二甲基亞砜中，用50mmol/L醋酸鈉-檸檬酸液（Ph4.9）稀釋10倍， 向每孔內加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反應在室溫下進行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸終止反應。于ELISA計數儀上450nm測定OD值。另外，引物的修飾除用圖2-3所示的生物素和FITC外，還可用DNA結合蛋白質的結合位 點和生物素修飾，將DNA結合蛋白質（GCN5或TyrR）包被在微孔板內，與PCR產物結合 后，可加入酶標親和素進行ELISA檢測。PCR-ELISA法可用于PCR產物定量分析。需注 意的是，定量分析時，PCR要在對數期內終止，并需設立已知標準對照。 
PCR-OLA法(A)
　　研究表明、不同個體中同源DNA    偏段序列間的差異大部分是限定于單個核苷酸的位 置。已弄清的人遺傳病的40個基因結構變異中，絕大部分屬堿基替換，同樣，作為遺 傳連鎖分析標記的大部分序列變異主要是位于基因組的非編碼區的點突變。所以，一 般基因檢測技術的一個重要要求是能很容易地檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試 驗（OLA）就是為此目的而設計的。它可以單獨或結合PCR快速確定緊密相關的DNA序 列。
　　OLA是通過設計兩種能與靶序列DNA精確并列雜交的寡核苷酸完成的。寡核酸雜交 后，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰堿基共價連接，而錯配的相鄰堿基可通過調節 連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產物可通過凝膠電泳觀察其大小，或通過5’端 修飾技術使一個寡核苷酸5’端帶有一個配基。連接后，通過固相化的親和配基使其 固定，漂洗后，檢測另一寡核苷酸3’端攜帶的適當標記分子。這一過程如重復進行 多個循環，則連接產物會呈線性增加，故稱這循環進行的OLA為連接檢測反應（LDR）。 此反應中若再加入兩種與上述寡核苷酸互補的寡核苷酸互補的寡核苷酸進行循環的連 接反應，則稱之為連接酶鏈反應。兩寡核苷酸在無靶序列的情況下，在非常接近的位 置發生雜交的可能性極小，因此，OLA技術的假陽性極少。另外，連接酶所形成的鍵 是連接產物。該法適于簡單、標準化的基因組樣品處理法，或直接用表面活性劑和蛋 白酶初步處理有核細胞作為檢測樣品。需指出的是，這里是以放射性標記檢測分子為 例的。如圖2-6中的地高莘標記分子可避免放射性同位素的缺點，且敏感性相當，更 易于自動化。
　　寡核苷酸的設計與標記：用于OLA的寡核苷酸一般為20mer，使被檢變異核苷酸位于 即將連接的兩個寡核苷酸接頭的5’端。即位于圖2-6中第2步左側寡核苷酸的3’端。 左側寡核苷酸是5’標記生物素。右側寡核苷酸5’端需磷酸化才能與左側寡核苷酸的 3’-OH相連接。用PNK酶處理很易使其5’或3’標記可以選擇其它標記物（如熒光素 等）。
　　OLA反應：向一軟質圓底微滴定板內依次加入：3μlPCR擴增DNA產物；1μl剪切的鮭精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混勻室溫作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混勻。加入1μl生物素標記探針水溶液（140fmol）和1μl32P探針（1.4fmol），2μlT4連 接(約0.1WeiSS單位，用5×連接緩沖液稀釋)。5X連接緩沖液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸與底物反應的連接所需酶液度不同，OLA試驗時，一定要小心滴定zui適 酶濃度，提高連接溫度（50℃）可擴加OLA的特異性。混勻，在100%濕度下于37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混勻，室溫下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）鏈霉親和素包被的瓊脂糖懸液，混勻后室溫作用 10min。將一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮過的Whatman4號濾膜置于點樣器 上，然后，將微孔板內混合液加入點樣孔內，真空抽濾點膜。再用數毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分別依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鮮包好進行放射自顯影。
打點雜交
　　當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過 程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再 用放射性或非放射性標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變 DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同 位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性 均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作 用。但是，由于同位素不穩定和放射性危害，不能常規用于臨床或 法醫檢驗。因而用非放射性物質（生物素、和地高莘等）標記的寡 核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的 方法。非放射性標記物質穩定性高、使用方便、安全、檢測速度 快。因此，本節僅敘述非放射性標記探針的點雜交與檢測情況。