實驗相關技術|PCR方法簡介

　　PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱，是一種酶促化學反應，可以在試管里將待測的目的基因在很短的時間內擴增物十萬倍乃至上百萬倍，大大提高了基因診斷的靈敏度，降低了分析的難度。PCR法是目前基因診斷中使用最多的方法。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。PCR技術自誕生之日起就決定了它不僅是一種檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進行定量分析的有力工具。

　　PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

　　②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　一、所需試劑

　　1. DNA模版

　　2．與DNA結合的特異引物

　　3．10×PCR Buffer

　　4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

　　5．Taq酶

　　二、操作步驟

　　1. 在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

　　10×PCR buffer 5μl； dNTP mix（2mM） 4μl；引物1（10pM） 2μl； 引物2（10pM） 2μl；Taq酶（2U/μl）1μl；DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μ；視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

　　2. 調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。 一般：在93℃預變性3-5min以激活DNA酶，進入循環擴增階段破壞DNA雙鏈間的氫鍵使其變為DNA單鏈，并與引物結合：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃ 保溫7min。

　　DNA聚合酶按照堿基互補規律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA。

　　3. 待反應結束，PCR產物放置于4-10℃待電泳檢測或-20℃長期保存。