小鼠βactin基因的克隆表達（2）

實驗步驟：

（1）目的基因與表達載體的連接反應：

①表達載體和目的片段的酶切

加樣后混勻，置于37℃水浴中，保溫3~4h。然后將酶切產物全部經瓊脂糖凝膠電泳后回收。

②表達載體與目的片段的連接

取一個200μl的EP管依次加入下列試劑：

2×buffer： 5 μl

pGEX 4T-1酶切回收產物： 1 μl

Pfu擴增并酶切回收的片段： 3μl

T₄連接酶： 1 μl

離心30Sec，使反應體系充分混合，16～22℃連接3～4h。

（2）克隆載體與目的片段的連接

取一個200μl的EP管依次加入下列試劑：

pMD18-T 1 μl

目的片段 4μll

Solution Ⅰ(含連接酶和buffer) 5 μl

離心30Sec，使反應體系充分混合，4℃過夜連接。

感受態細胞的制備及轉化

實驗目的：把體外重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選出轉化子。

實驗原理：所謂感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態。關于感受態的本質說法很多。目前主要有兩種假說：1.局部原生質體化假說—細菌表面的細胞壁結構發生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA分子能通過質膜進入細胞。2.酶受體假說—感受態細胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進入細胞。

DNA分子的轉化過程如下：1.吸附—完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌的表面。2.轉入—雙鏈DNA分子解鏈。單鏈DNA進入受體菌，另一條鏈降解。3.自穩—外源質粒DNA分子在細胞內又復制成雙鏈環狀DNA。表達— 供體基因隨同復制子同時復制，并被轉錄翻譯。
實驗步驟：

（1）感受態的制備

① 從LB平板上挑取單克隆于5ml LB培養基中，37℃ 200rpm搖菌12～16h。

② 將活化過的菌按1～5％的體積比接種到新的LB液體培養基中，37℃ 200rpm搖菌約2h，OD₆₀₀約為0.4。

③ 取1.5ml搖好的菌液于一1.5ml的EP管中，4℃ 4000rpm離心3min，棄上清。

④ 加250μl 0.1M的CaCl₂（滅菌預冷）溫和懸浮菌體，4℃ 8000rpm離心1min棄上清。

⑤ 加200μl 0.1M的CaCl₂（滅菌預冷）溫和懸浮菌體，為感受態細胞。置于4℃ 存放。

（2）轉化

① 將盛有感受態細胞的EP管放置于冰上10min，加入10μl連接產物，溫和混勻，冰浴20~30min。

② 42℃熱激90S。冰浴5~10min。

③ 加入800μL LB液體培養基，37℃培養45～60min。4000rpm離心2min，棄去800μl上清液，剩余混勻用來涂板。

④ 取含有50～100μg/ml Amp的LB平板培養基（若進行藍白斑篩選，在培養皿上先涂布4μl 200mg/ml的IPTG和40μl 20mm/ml的X-Gal），涂板。

⑤ 37℃倒置培養16~20h。

克隆的篩選與鑒定

實驗目的：掌握快速鑒定陽性克隆的菌落PCR法；了解質粒DNA的制備原理及分類根據，掌握堿變性法質粒DNA小量制備及酶切鑒定的方法

實驗原理：堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA、質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調節其pH到中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被出去。

實驗步驟：

（1）菌落PCR鑒定法

待轉化的細菌菌落長直徑到2mm時，直接用接種針或牙簽挑取少許菌體加入30μ的PCR反應體系中。

然后挑取菌落剩余部分，劃在培養皿上作好標記的方格內；同時在對應編號的含5ml LB液體培養基的培養管中接種。