實驗原理
巨噬細胞(MΦ)發育:骨髓多能干細胞→定向干細胞(髓樣干細胞)→單核母細胞→前體單核細胞→單核細胞→血液→組織(分化為巨噬細胞)
MΦ分布:單核細胞主要于血液中,巨噬細胞幾乎存在于所有表皮和黏膜下組織。 MΦ形態:有偽足,馬蹄狀單核,細胞形體大。
MΦ分離純化:小鼠和大鼠腹腔內有豐富的巨噬細胞,可用腹腔清洗的方法獲得較多細胞懸液。正常小鼠每只可收集腹腔滲出細胞106,其中30%為巨噬細胞,如果給小鼠腹腔注射某中刺激物,可使巨噬細胞滲出增加,易于分離更多的巨噬細胞。
純化:巨噬細胞易于沉降和貼壁,對X射線不敏感,而淋巴細胞和成纖維細胞對X射線敏感。
操作步驟
(1)將小鼠以頸椎脫臼法處死,仰臥,固定四肢。
(2)依次用碘酒及酒棉球消毒腹部,以鑷子提取腹壁,剪去一小塊皮膚,繼以鑷子提取腹腔。剪一小口。以注射器注入少量沖洗液。用滴管吸出,再注入沖洗液并吸出,滴管在腹腔內各個位置吸取液體,沖洗每只小鼠腹腔約共 5 mL
(3)將腹腔細胞懸液滴于干凈玻片上,置 37 ℃ 濕盒內。 1~2h后傾去玻片上的液體。并用腹腔沖洗液輕洗玻片,即可見玻片上有毛玻璃樣的單層核巨噬細胞粘附,巨噬細胞含量可達90%。
(4)在顯微鏡下計算巨噬細胞的百分比,以檢測分離結果。
注意事項
(1)皮膚和腹膜要分別剪開,并確保皮膚血液 不流入腹腔。
(2)腹腔內的沖洗液要全部吸干。
(3)腹腔沖洗液洗玻片時要適量,既要保證將鹽分清洗干凈,又不將細胞洗脫。