小鼠ES細胞的分離方法基本成熟，且已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。1981年Evans首次分離得到小鼠ES細胞，他以手術切除受精后2.5d小鼠卵巢并結合激素注射干擾子宮環境，從而使胚胎延遲著床，再回收胚胎，將其體外培養于STO細胞飼養層上，結果得到了小鼠ES細胞系。MartinGR以免疫外科法剝離小鼠囊胚滋養層細胞，得到內細胞團(ICM)并將其置于STO細胞飼養層上，培養基為小鼠PSA-1ES細胞條件培養基，結果也得到小鼠ES細胞。此后，Axelord等用微滴法得到小鼠ES細胞系；Kaufman等用單倍體延遲著床小鼠囊胚建立同源二倍體ES細胞系；Wobus等首次用原代小鼠成纖維細胞作飼養層建立了小鼠ES細胞系；Smith等首次使用大鼠肝細胞條件培養基作為分化抑制物建立了小鼠ES細胞系。BrookFA等進一步完善了小鼠ES細胞的分離方法，以致從許多品系小鼠包括近交系和突變系，都可獲得ES細胞。分離小鼠ES細胞并非只能從囊胚，也并非必須依賴飼養層細胞。Dhhaise等將52枚8-細胞小鼠胚胎消化成單個分裂球并培養于小鼠原代成纖維細胞飼養層上，所用培養基為DMEM/F12，并添加100mL/L的胎牛血清、100mL/L的新生犢牛血清和0.1mmol/L的2-巰基乙醇，5天后，出現多個干細胞集落，消化傳代后建立了一個ES細胞系MSB1。將MSB1注入SCID(severecombinedimmunodeficientmice)小鼠，能產生包含三胚層分化物的畸胎瘤，注入52枚囊胚產生了2個活的個體(1雄，1雌)，但雄性個體無生殖能力。Tojo等用同樣方法從雜交小鼠(C57BL/6×DBA/2)8-細胞胚也得到了ES細胞。小鼠ES細胞具有無限增殖的自我更新能力。SudaY等將小鼠ES細胞傳250代以上沒有出現轉化的跡象，它們仍具有正常的二倍體核型；在生殖系嵌合體中能產生正常的配子；作為核供體能重組克隆胚胎。上述結果表明小鼠ES細胞是永生性的。