平端DNA連接的優缺點、要求條件和實驗步驟

T4噬菌體DNA連接酶不同于大腸桿菌DNA連接酶，它可以催化平端DNA片段的連接（Sgaramella和 Khorana，1972;Sgaramella和Ehrlich，1978），由于DNA很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何DNA分子彼此相連。

優點：

1、沒有連不上的，只有切不開的。平末端連接不牽扯到粘性末端的堿基突出問題，所以，理論上任何兩條DNA序列都能連接在一起，當然需要 ligase的酶學作用。這個不同DNA分子之間的連接帶來了極大地便利，因為平末端自然是這樣，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以經過處理成為平末端。

2、有時候，兩個平末端連接在一起以后，可以產生另一種內切酶的識別序列，為后續的克隆工作提供了一種機會。

缺點：

1、連接效率比粘性末端低：連接效率之所以比較低，原因之一是在連接過程中只有連接酶的作用，缺乏粘性末端那樣突出堿基的互補作用；原因之二是常用的T4DNAligase對于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。

2、可能產生雙向插入：由于平端連接的末端沒有特異性，連接的時候不能定向，所以兩種方向的插入都有可能。這個時候就需要有一種有效的鑒定方法。一般分別在載體和目的片段選擇一個酶切位點進行酶切鑒定，當然，具體的鑒定方法要根據具體的實驗而定。

3、可能多拷貝插入：平端連接時，可能目的片段多個插入，并且在多個插入的時候還有可能每個插入子以不同方向連接，導致有時候結果難以解釋。一般目的片段越大，多拷貝插入的可能就越小。

平端連接要求的條件：

1、低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka，1981）。

2、不存在亞精胺一類的多胺。

3、極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。

4、高濃度的平端。

實驗試劑：

凝聚劑：在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致DNA分子凝聚成集體的物質，如聚乙二醇（Pheiffer和 Zimmerman，1983;Zimmerman和Pheiffer，1983;ZimmermanT Ｈarrison，1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders，1985），可以使如何取得適當濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩作用：

1、它們可使平端DNA的連接速率加大１－３個數量級，因此可使連接反應在酶DNA濃度不高的條件下進行。

2、它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣，即使在有利于自身環化（j:i=10）的DNA濃度下，所有的DNA產物也將是線狀多聚體。

聚乙二醇（PEG8000）：

1、用去離子水配制PEG8000貯存液（40%）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應混合物之前應將其融化并使其達到室溫。在含15%PEG 8000的連接反應混合物中，對連接反刺激效應最為顯著。除PEG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應于0℃混合，然后加適當體積的PEG 8000（處于室溫），混勻，加酶后于20℃進行溫育。

2、連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或MgCl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度（Pheiffer和Zimmerman，1983）。

3、濃度為15%的PEG 8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應的主產物是串聯的多聯體。

4、PEG 8000可刺激短至8個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。

氯化六氨合高鈷：

1、氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為 1.0-1.5μmol/L時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的5倍（Rusche和Howard-Flanders，1985）。

2、在單價陽離子（30mmol/L KCl）存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用，但此時連接產物的分布有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物，相反，環狀DNA將點盡優勢。

3、與PEG8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。

實驗步驟：

(以20μl 酶切完后的體系為例）

1、如果要補平或切平，先將樣品置于70度水浴10min，將體系放大到50μl，其中按照說明書加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等。

2、常溫反應10min后將反應物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反應5min。

3、凝膠回收處理的載體或片斷。

4、CIAP處理。

5、苯酚氯仿純化，最后乙醇回收。

6、連接反應。

注意事項：

1、插入片斷和載體片斷的比例要高。

2、連接酶要加的多點，最好用高濃度的酶。

3、載體片斷要做去磷酸化處理。

4、也可以用15%的PEG8000來增加連接效率和減少載體自聯。

5、反應體系10μl，不要太大。

6、載體片斷不要加多了，一般酶切跑 并割膠純化并去磷酸化后加0。5微升就可以了。

7、去磷酸化的步驟要根據自己酶的性質而定，一般要反應一個小時，在反應半小時后再補充酶再反應半小時。

8、插入片斷和載體片斷要酶切良好。