當外泌體遇上環狀RNA（二）

（4）circUHRF1通過miR-449c-5p相關途徑來抑 制NK細胞功能
作者利用生物信息學預測了14個miRNA，在NK-92細胞中進行circUHRF1-RIP以及qPCR，結果表明miR-449c-5p是NK-92細胞中一個與circUHRF1相互作用的miRNA。在NK-92細胞中進行抗AGO2抗體的RIP和生物素化miR-449c-5p的RNA pull-down實驗，證明了circUHRF1可以直接與miR-449c-5p結合。此外經雙熒光素酶報告實驗和分別在NK-92細胞中過表達circUHRF1和miR-449c-5p，證明了在NK細胞中circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向。此外單獨過表達miR-449c-5p會顯 著抑 制腫 瘤的活性，但增加circUHRF1表達顯 著抑 制miR-449c-5p的腫 瘤抑 制功能，說明HCC衍生的外泌體circUHRF1通過miR -449c-5p相關途徑抑 制NK細胞功能。

（5）circUHRF1通過抑 制miR-449c-5p來上調TIM-3的表達

作者分析了NK細胞中預測的miR-449c-5p靶基因TIM-3，同樣進行了雙熒光素酶報告實驗，結果顯示miR-449c-5p能直接與靶基因TIM-3的3’UTR區直接結合。超表達miR-449c-5p后TIM-3表達顯 著降低。為了驗證NK細胞中外泌體circUHRF1的持續上調吸附miR-449c-5p，從而導致TIM-3的表達上調造成HCC的免疫逃避這一觀點。作者檢測了miR-449c-5p單獨或與circUHRF1共同轉染的NK-92細胞中TIM-3的表達。結果顯示，miR-449c-5p超表達導致TIM-3 mRNA和蛋白表達水平下降，而circUHRF1逆轉了miR-449c-5p的抑 制作用。在體內同樣證實了circUHRF1通過調控miR-449c-5p/TIM-3軸來阻礙NK細胞的功能。

（6）circUHRF1以NK細胞依賴性方式促進HCC進展
為了進一步探討circUHRF1在HCC中的作用，使用pLO5-ciR-circUHRF1上調了PLC / PRF / 5細胞中circUHRF1的表達。qPCR結果顯示，在過表達circUHRF1的HCC細胞中，外泌體circUHRF1水平也顯 著上調。此外，使用PLC/PRF/5細胞構建肺轉移的NOD/SCID小鼠模型(注射來自健康供者的NK細胞)。結果表明，在接種過表達circUHRF1細胞的肺轉移小鼠內，血漿外泌體中circUHRF1水平更高，肺部的轉移瘤結節更多及結節內NKG2D陽性細胞更少。說明，circUHRF1以外泌體和NK細胞依賴性的方式促進HCC進展。

（7）circUHRF1可以提高肝ai對抗PD1治 療的耐藥性
分析了30例進行肝切除術并接受抗PD1免疫治 療的HCC患者的資料并測定circUHRF1的表達水平，結果表明，PD組的circUHRF1水平明顯高于SD組和PR組。此外，檢測了30例HCC患者組織中NKG2D的表達水平。結果表明，與抗PD1治 療敏感的HCC患者相比，抗PD1治 療耐藥的HCC患者中NKG2D的陽性細胞數明顯減少。為直接評估circUHRF1對抗PD1治 療的影響，通過皮下植入circUHRF1基因敲低的HCCLM3細胞或相應的陰性對照細胞來構建小鼠移植瘤模型。結果表明，植入circUHRF1基因敲低細胞的小鼠對抗PD1治 療敏感，并伴隨總生存率的提高。根據上述研究，過表達circUHRF1可以提高HCC對抗PD1治 療的耐藥性，而靶向circUHRF1可能是恢復HCC對抗PD1治 療敏感性的有效方法。