1、核酸分子的濃度和場地：核酸分子濃度越高，復性速度就越快，探針長度最好選在50-300個堿基；
2、溫度：溫度偏高不利于復性，溫度偏低則不利于少數堿基配對形成的局部雙鏈的解離，適合的溫度是較Tm值低25度；
3、離子強度：離子強度越高，雜交反應越快，而且高濃度的鹽有利于穩定錯配堿基雜交體的穩定性增加，所以在進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交液和洗膜液中鹽濃度；
4、雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交反應的Tm值，其優點在于：在低溫下探針的穩定性增加，且更好地保留非共價結合的核酸；
5、核酸分子的復雜性：是指存在于反應體系中不同順序的總長度；
6、非特異性雜交反應：在開始核酸分子雜交之前須對非特異性雜交位點進行封閉，以減少其對探針的非特異性吸附作用。