基因敲出質粒轉染可以構建穩定細胞株
一種是脂質體轉染后,單克隆篩選穩定細胞株.另外一種是應用逆轉錄病毒,慢病毒轉染,篩選穩定細胞株.
脂質體轉染：在轉染24小時后,消化細胞并計數.將細胞種到96孔板,保證每個孔2-3個細胞,這樣才能得到單克隆.待細胞貼壁后,加入抗生素篩選.篩選時間和濃度視細胞而定.一般G418一個星期作用,嘌呤霉素2-3天.
脂質體法篩單克隆時間較長,且效率低,大概只有1%.
病毒轉染：先要用包裝細胞,一般為293細胞,包裝出病毒,再用病毒轉染目的細胞.包裝病毒視不同類型的病毒而定,一般要3-5天的時間.包裝好的病毒要測滴度,根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量.轉染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩定細胞株.
病毒轉染得到穩定細胞株的效率高,只是步驟繁瑣.