核酸檢測技術及其在國內外血液篩檢中的應用（一）

  輸血相關傳染病的預防和控制已經成為全社會關注的焦點,新技術的引進是進一步提高血液安全性的重要一環。本文就病原體核酸檢測技術(nucleic acid testing, NAT)及其在國內外血液篩檢中的應用情況和結果作一介紹,并對該方法在我國推廣和應用的必要性和可行性作初步探討。

1.　NAT在血液篩檢中的必要性

      酶免檢測(EIA)技術已經廣泛運用于血液篩檢,該方法的靈敏度和特異性也在不斷地改進和提高,但每年仍有少數新發輸血后肝炎病例報道,如美國無償獻血者每單位供血傳播HBV、HCV和HIV的危險性分別為1∶66000、1∶103000和1∶676000^[1]。這些危險的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”獻血,病毒變異,免疫靜默感染(immuno silent infection)以及人工操作錯誤^[2]。所謂“窗口期”,是指從感染病原開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原存在為止的這一段時間^[3]。血清學抗原、抗體檢測的“窗口期”較長, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV檢測的“窗口期”分別為45-56ｄ、22ｄ、72ｄ^[4,5],故美國90%以上輸血傳播HIV和HBV以及75%以上輸血傳播HCV的危險性來自“窗口期”感染獻血^[6]。EIA“窗口期”漏檢是當前影響血液安全性進一步提高的瓶頸,對于獻血者的篩選,單純抗原或抗體血清學檢測不能有效地保障血液安全。  

      NAT檢測是直接檢測病原體核酸的一系列技術的總稱。其基本步驟包括核酸提取、擴增、和檢測。NAT敏感性高,可檢出標本中極微量的核酸,在病毒感染后數天即能檢出,可大大縮短“窗口期”。初步研究表明,混合血樣NAT檢測可將HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短9d(縮短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)^[5,7];此外NAT還可以檢出因上述其它3種原因而漏檢的被感染獻血。如法國應用NAT,從大約150萬份獻血中篩檢出4份HCV RNA陽性、抗體陰性的樣本,其中1份即為免疫靜默感染^[8]。盡管NAT從理論上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸轉陽之前的血液傳染性極低,可以有效地預防經輸血傳播病毒性疾病^[9]。因此,NAT的引入可使輸血傳播疾病的危險性降到最低^[10]。

2.　NAT檢測的技術方法

      1985年具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)的發明,標志著NAT的誕生。隨后,在PCR的基礎上,派生出許多其它原理的體外NAT方法 ^[11]。這些技術靈敏度和特異性或高或低,操作或簡單或復雜,適合在各自不同的領域運用，目前適用于大樣本量血液篩查并能滿足高靈敏度要求的擴證擴增技術主要為PCR技術和TMA技術。

2.1　PCR擴增方法　

      PCR是一種體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術,以其高敏感性、高特異性和快速簡便等優勢得到了廣泛的應用。通過簡單的技術改進和聯合,涌現出了各種各樣不同的PCR方法,如檢測RNA的逆轉錄PCR(RT PCR)、敏感性和特異性均較高的巢式PCR (nested PCR)、可對靶序列進行定量檢測的定量PCR、檢測基因超長分布的多重PCR以及PCR結合酶標技術(PCR ELISA)、PCR結合寡核酸探針雜交技術(PCR SSOP)、熒光PCR和免疫PCR等。

      目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、病毒滴度監測以及療效評估,因采用熒光標記的探針雜交或直接使用能和雙鏈DNA結合的熒光素檢測PCR擴增產物,進一步提高了檢測的敏感性和特異性。若加入已知濃度的內標或外標,便能進行定量檢測。由于該方法實現了反應體系的全封閉和操作的全自動,不僅減少了污染,還提高了效率。

      雖然國內許多生物技術企業已經利用熒光PCR方法開發出成熟的NAT定量檢測產品,如深圳匹基、廣州達安、上海復星、上海科華、上海浩源等,但這些產品均只獲得我國食品和藥品監督部門的臨床診斷使用許可證。而臨床診斷和血液篩檢是2個不同的應用領域, 血液篩檢對試劑的要求要比臨床診斷高很多。迄今為止正式通過美國FDA認證可用于血液篩檢的試劑僅有2種,即Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV和 HIV 1/HCV檢測系統,FDA評判這些試劑是否能用于血液篩檢的標準之一: 必須對50copies/ml的病毒核酸的檢出率>95%。相當一部分國產熒光定量PCR檢測試劑或許能在某些標本上獲得20copies/ml的靈敏度,但一般都很難滿足95%檢出低病毒載量標本的要求。相信不斷提高檢測靈敏度,早日研發并注冊成功我國自己的NAT血液篩檢用試劑也是國內生物技術企業的發展目標。

2.2　轉錄介導的擴增方法

      包括轉錄介導的擴增系統(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依賴擴增系統(nucleic acidｓsequence based amplification,　NASBA)。TMA是一種利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆轉錄酶和T7 RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反應系統,主要擴增原理為: 目標序列在逆轉錄酶作用下,以引物為引導進行逆轉錄, 逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,轉錄出成千上萬個目標RNA序列,這些RNA又可以作為模板進行下一個循環,整個反應是一個自催化過程。NASBA的原理與TMA相似,只是在核酸提取和擴增產物檢測的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強,靈敏度高,反應條件簡單,擴增效率高,無需專門的擴增儀器,且因整個反應在1個試管中進行,也減少了污染。

2.3 其它NAT技術　

      包括支鏈DNA檢測技術(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、環介導的等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、連接酶鏈技術(ligase chain reaction, LCR)和鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)等。這些技術或因為自身原因,或因為剛研發出來尚未進入臨床,均未在血液篩檢中應用。如bDNA技術，在1995年左右推出,其信號放大是通過堿性磷酸酶(AP)標記的探針雜交結合到一個樹枝狀核酸枝狀體上而實現的。bDNA技術對待測DNA無擴增,特異性較好,能進行病毒定量檢測,動態地揭示病毒滴度水平的變化,不僅在預測干擾素療效方面可為臨床提供更為有用的信息,還可作為丙肝病人對干擾素完全應答的標志反應。但也正因為bDNA技術沒有擴增待測核酸,其檢測靈敏度遠遠低于PCR,故該項技術實際上不適合用于血液篩檢,目前國內主要將bDNA技術用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。

3.　NAT在國內外血液篩檢中的應用

3.1 開展NAT檢測的國家及所用的技術

      NAT是一種新興的檢測方法,許多國家及輸血機構都進行了一系列的研究,在國外特別是一些發達國家和地區已普遍應用于血液篩檢^[12]，例如,日本是世界上最早在全國范圍內對血液進行HBV、HCV、HIV NAT篩檢的國家^[13],新加坡、中國香港也已經分別采用不同的方式對血液進行NAT篩檢; 德國和荷蘭從1997年起就開始NAT篩檢的嘗試,英國和法國的部分血站也從2000年起開始了NAT血液篩檢; 美國則從1999年3月開始在FDA新藥審核程序下使用不同的試劑進行常規血液篩檢。開展NAT檢測的國家及其所采用的技術見表1：

表1.　開展NAT檢測的國家及所用技術匯總

      各國采用的技術各不相同（參見表1）。日本使用的方法為羅氏公司與日本紅十字會共同開發的全自動的Ampli NAT^ＴＭ NPX系統（為熒光PCR技術，可同時聯合檢測HBV,HCV和HIV），目前正在考慮使用Chiron公司的TMA技術;　美國ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技術;美國血液中心(ABC)系統則使用羅氏COBAS Ampli Screen; 荷蘭及部分歐洲國家將荷蘭阿克蘇公司推出的

      Nucliesens全自動核酸提取方法同羅氏的COBAS Ampli Screen擴增體系結合起來使用;而英國和法國的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自動核酸提取系統與羅氏的COBAS Ampli Screen擴增體系結合起來的方法, 隨后部分血站又更換成Chiron的TMA技術。各血站根據自身特色, 正在對各種不同的技術組合進行評估, 目的是尋求一種最適合的NAT技術,既保障血液安全,又能保證血液的及時供給,還要做到省時省力。