日前，以“精細管理、精準醫療”為主題的2016屆CSCO學術年會在廈門落下帷幕，精準檢測作為臨床實踐中實施精準醫學的第一步，成為本屆CSCO學術年會的熱點話題。來自不同企業的分子診斷技術百花齊放百家爭鳴，面對新技術與成熟技術的較量，在“精準醫學”時代下，如何選擇合適的檢測技術，實現精準治療成為新醫學形態下人們亟需解決的問題。
近期，美國萊斯大學DmitriyKhodakov教授在國際知名期刊《Advanced Drug Delivery
Reviews》（IF=15.606）發表的綜述文章，也許能給我們一個答案。該文對精準醫學關鍵的基因檢測技術手段進行了梳理，作者認為目前實現臨床轉化的核酸檢測技術可以分為三大類：PCR技術、雜交技術和測序技術，介紹了這三類技術，并對其臨床應用發表了自己的見解。以下是對該文主要內容的介紹。
PCR技術
PCR技術是目前應用最廣泛的DNA分子檢測技術。與雜交技術和測序技術相比，PCR技術優勢主要在于、高敏感度、易于推廣。其主要局限在于多重基因聯合檢測時可涵蓋的基因數量受限。
1、ARMS
擴增阻滯突變系統（ARMS）是使用廣泛的一種核酸變異檢測技術，已有多家公司開發出基于此技術的腫瘤突變基因檢測試劑盒產品，如Qiagentherascreen、Roche Cobas、BiomerieuxTHxID以及中國的AmoyDx等。
2、Blocker PCR
Blocker PCR技術通過引入blocker序列來抑制野生型基因擴增從而達到檢測核酸變異位點的目的。目前已有基于此技術的腫瘤基因突變檢測試劑盒產品問世，如PNA Bio開發的PNAClamp試劑盒。
3、多重PCR
多重PCR技術需要解決擴增抑制、熒光基團的數量限制、引物二聚體等問題，其工程學解決方案主要通過開發設備和一次性芯片等來解決。Biofire
Diagnostics(現被Biomerieux收購)和Cepheid都開發出用于感染性疾病診斷的多重PCR試劑和儀器。
4、數字PCR
數字PCR技術通過將一個樣本分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析，從而實現高靈敏的絕對定量檢測。目前數字PCR主要用于科研及臨床研究，也有開發LDT方法用于臨床，如Trovagene
PCMBRAFV600E試驗。
雜交
雜交是一種將合成的DNA探針或引物與目標序列結合的過程。與PCR技術和NGS技術相比，雜交的主要優點在于操作簡單、可多重檢測、結果可靠，其缺點主要在于該方法不能進行序列擴增，因此必須依賴于信號放大技術或者高靈敏的檢測設備。
1、微矩陣
微矩陣通過靶基因與固定在芯片上的探針發生特異性雜交，結合在芯片上不同位置的探針對應不同突變，熒光強度代表濃度，從而實現一次檢測多種基因突變或者基因表達水平的目的。因此，其檢測靈敏度取決于靶基因和探針的雜交效率及熒光顯微鏡的分辯能力。FDA已批準多個微矩陣技術產品，如Agendia開發的用于乳腺癌檢測的MammaPrint試劑盒等。
2、熒光條形碼單分子檢測技術
熒光條形碼單分子檢測技術是一種高通量檢測技術。可分為兩大類：intensity barcodes和geometric
barcodes，intensity
barcodes在二氧化硅顆粒上標記不同密度的熒光標記，通過捕獲有目標基因的顆粒的熒光信號來檢測突變類型；而geometric
barcodes是利用光譜上不同的熒光基團的組合來檢測不同序列。其中Luminex開發的基于intensity
barcodes方法的呼吸道疾病診斷技術已獲得FDA批準。
3、原位雜交（ISH）
原位雜交不僅提供目標基因的序列和濃度信息，而且可實現目標基因的細胞定位，尤其適用于異質性細胞及組織樣本的基因擴增檢測。原位雜交技術有熒光原位雜交（FISH）、顯色原位雜交（CISH）或者銀染原位雜交（SISH）等，原位雜交技術可應用于DNA和RNA的檢測，目前，FISH主要用于DNA擴增檢測，如Roche和Abbot開發的HER2擴增檢測試劑盒。
新一代測序技術（NGS）
NGS是一種高通量檢測DNA和RNA變異的方法，與Sanger測序不同，NGS可檢測多種樣本，且可以同步提供大量的基因變異信息，因此該方法非常適合于并行檢測和分析多種基因和變異信息。
沒有一種方法是完美的，由于背景信號干擾、酶的擴增錯誤率、化學反應不徹底等問題，所有的NGS平臺都有一定的內在錯誤率。而測序過程中的錯誤會增加突變檢測的難度，特別是低頻突變。
1、主流NGS平臺
主流NGS平臺有Illumina和IonTorrent的的NGS系統，Illumina在序列錯誤率和成本控制上處于領先地位。在診斷應用方面，Illumina開發有Miseq和NextSeq兩個平臺，其中MiseqDx是首個獲得FDA許可用于IVD的NGS平臺。
2、其他平臺
其他平臺還有：適用于長序列檢測的SMRT NGS平臺（Pacific Bioscience），以及Nanopores NGS平臺（Oxford、Genia Technologies）等。
作者觀點
NGS實驗操作復雜且成本高，由于其高通量的序列分析能力，已經成為許多序列變異分析與科研應用的主要選擇。然而，從臨床診斷應用的角度，檢測的目標位點必須具有明確的臨床價值，因此相對于NGS技術而言，PCR技術的簡便性、穩定性和使用的廣泛程度意味著在未來一段時間內PCR技術依然是核酸突變位點檢測的不二選擇。
在可預見的未來里，技術的發展將扮演重要的角色。雖然NGS技術單位通量價格在近10年極大地降低，但是依然離整個基因組或轉錄水平的全面深度測序至少6個數量級的差距。DNA序列變異分析的優化和創新將主要集中在價格，準確性，運行周期，操作復雜度和實驗室的規范化等方面。
原文：DmitriyKhodakova, 1, ChunyanWanga, 1, David Yu Zhanga, b, Diagnostics
based on nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization,
and NGS approaches，Advanced Drug Delivery Reviews 105 (2016) 3–19.