六、Caspase-3活性的檢測
Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
結果：[圖8-1、圖8-2]
2 熒光分光光度計分析
原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?制備細胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應1h?熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm）。
結果：[圖9]
3 流式細胞術分析
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應1h?UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均熒光強度。
結果：[圖10]
七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。
（一）TFAR19蛋白的細胞定位分析
材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
方法：
1 懸浮細胞的染色：
（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。
（5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應30min
（6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
結果觀察：將細胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。[圖11]
2：貼壁細胞的原位染色
（1） 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。
（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微
鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。
結果觀察：[圖12]
3：臨床病理切片的染色、檢測。
4：原代細胞的培養、檢測。
5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）
4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 顯色液（現配現用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板機
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜（一般24h以上）。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
過夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
2． Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。
◆ 細胞凋亡與肝病（一篇綜述）
摘要：細胞凋亡是能量依賴的細胞內死亡程序活化而致的細胞自殺。細胞凋亡偏重于凋亡小體的形態學的變化過程，并且可見于許多非生理狀態，如疾病所引起的細胞凋亡和抗癌藥物所引起的癌細胞死亡等，而程序性細胞死亡則偏重于其分子生物學和生理性功能，一般指生理性死亡。近年來有關肝病凋亡的論文發表量日益增多，本文就此進行綜述。
一 、細胞凋亡的特征和檢測方法
細胞凋亡在形態學上有四大特征：1）、細胞變圓，2）、胞漿起泡，3）、核固縮，4）、凋亡小體形成。形態學觀察到凋亡小體是細胞凋亡的金標準，但此法并不敏感。（1）瓊脂糖凝膠電泳對凋亡細胞基因組進行分析發現其DNA片段呈180-200bp的階梯狀的電泳條帶。檢測出這種典型的電泳條帶是細胞凋亡的可靠指標。（2）近年來用于檢測細胞凋亡的技術還有 TUNEL 法，通常認為其對細胞凋亡數量的估計過高。（3）因此在研究細胞凋亡時應盡可能的做瓊脂糖凝膠電泳作為對照。另外還有流式細胞儀法測凋亡細胞峰法，通常認為它可以測定細胞凋亡的數量，并能夠將壞死細胞、活細胞區分開來，是一種比較好的檢測方法。可進行定量半定量的分析。（4）
在肝臟凋亡小體被認為就是Councilman 小體、嗜酸性小體和固縮壞死。（5）并且發現肝臟凋亡發生迅速，可在幾分鐘、幾小時內完成。通常凋亡細胞的清除是一個不伴有炎癥的過程，因為細胞內的內容物被膜包裹形成凋亡小體而被枯否細胞、臨近的肝細胞清除，細胞內的酶不外溢。這通常是對的，然而肝細胞的凋亡并非人們所想象的那樣隱蔽而不容易被發現，在肝細胞的凋亡過程中可以檢測到細胞內酶，并且當凋亡的肝細胞的數量超過肝組織的清除能力時，組織結構的丟失將會發生炎癥，因此細胞凋亡在過去認為由細胞壞死觸發的許多疾病中可能起重要作用。（6）
二、細胞凋亡的機制
在凋亡的過程中，凋亡啟動階段可以與凋亡執行階段區分開來，在執行階段 Caspases( 一組新的特異性水解底物天冬氨酸殘基的半胱氨酸蛋白酶家族)，可以依次激活來水解細胞和裂解一些關鍵的蛋白。Caspases通常以酶原Procaspases的形式存在于細胞胞漿內，需要蛋白酶先將其裂解為有功能的蛋白酶的形式才可發揮作用。并且現在認為Procaspases具有Caspases的活性，但其活性較Caspases為低。如Procaspase-8具有活化Caspase-8 1%~2%的活性。所以Procaspase-8相互聚集時可以自我激活或相互激活為Caspase-8。Procaspases的相互聚集可由結合調節分子介導,如CARDs(caspases recruitment domains) 和DEDs(death effector domains)，CARDs和DEDs與Fas 和p75NGF 受體死亡區域具有相似的結構（6個折疊閉環，兩歧性反向平行的α螺旋）。因此Procaspases可以相互聚集形成“apoptosome”來激活 Caspases。之后Caspases可將蛋白從天冬氨酸鹽羥基端一分為二。同時Caspases自身也是通過對其天冬氨酸殘基進行裂解而激活。通常認為Caspases是通過其他的Caspases的裂解而激活。Caspases激活Caspases的過程會導致Caspases的級聯放大反應。Caspases(-3，-6，-7)被認為是Caspases中下游的Caspases，并且是分解底物的關鍵酶，是細胞凋亡的執行者。近來已發現兩條激活Caspases的通路。一條涉及到死亡因子和死亡受體，另一條與線粒體功能障礙有關。(7)
死亡受體是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的成員。到目前為止共發現8種死亡受體，其中TNF受體1（TNF receptor-1,TNF-R1）和Fas（又稱CD95/APO-1）白被研究的最多，它們均通過其配體而被激活起作用。Fas和TNF-α可以動員細胞內不同的死亡復合體伴隨的調節蛋白和procaspases 而活化死亡復合體，然后由死亡復合體激活一系列的上游Caspases，最主要的是Caspase-8,由它激活下游的Caspases 蛋白酶來執行促使細胞凋亡的作用。(7、8)
在第二條通路，細胞應激可以促發細胞色素C從線粒體上脫落，這通常可能是通過線粒體內膜的通透性改變而介導的。脫落的細胞色素C與 Apaf-1結合后而激活Caspase-9, Caspase-9然后激活下游的Caspases執行促使細胞凋亡的作用。(7)近來的資料表明線粒體和死亡復合體可以通過Bid蛋白聯系起來，Caspase-8激活Bid蛋白，Bid蛋白隨后可以誘導線粒體釋放細胞色素C。Bid 蛋白是Bcl-2家族的一員。目前還發現其它幾種胞漿蛋白參與細胞凋亡的調節，主要是 Bcl-2的家族成員。目前在哺乳動物中已鑒定出至少１５種Bcl-2蛋白。它們可以分成兩大類：促進細胞凋亡的，如Bax、Bak、Bok Bcl-xS、Bag、Bid、Hrk、BNIP3、BimL、EGL、Blk和Bad；抑制細胞凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1、Brg-1、和A1。(9,10)促進和抑制細胞凋亡的Bcl-2家族成員能結伴形成同源或異源二聚體。抗細胞凋亡的Bcl-2家族成員可以與線粒體結合抑制其釋放細胞色素C，發揮抗細胞凋亡的作用。(11)已有的研究表明當Bcl-2/Bax>Bax/Bax時，細胞趨向于存活，當Bcl-2/Bax〈Bax/Bax時，細胞趨向于凋亡。盡管Bcl-2家族成員在調節凋亡中的確切作用不十分清楚，但Bcl-2家族之間的相互平衡最終決定凋亡刺激因素是否導致細胞發生死亡。(1)
三、細胞凋亡在肝病發病中的作用
１ 酒精性肝病
到目前為止僅有有限的關于細胞凋亡在酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）發病中作用的報導。但是細胞凋亡在ALD發病中的作用卻日益明朗化。事實上凋亡在ALD中的表現形式是嗜酸性小體，而且凋亡的標志物和Mallory小體可以在ALD 的肝細胞中同時觀察到，提示這些細胞在組織中是通過凋亡的形式被清除的。同時在實驗性ALD也可發現肝細胞凋亡，長期給予酒精的小鼠肝細胞內可見凋亡小體的數量明顯增多，主要集中在肝小葉中央靜脈末端的周圍，這些病變在終止酒精給予后可逆。另一研究表明伴有肝損傷（如脂肪肝或肝炎癥侵潤）的酒精飼養大鼠肝細胞凋亡細胞數量增加。潛在的肝病理狀態，使肝細胞更易于發生酒精誘導的肝細胞凋亡，這在肝鐵超負荷時可以見到，而肝鐵超負荷可見于許多酒精性肝病患者。在一個研究肝鐵影響的大鼠模型中，在這些動物中凋亡細胞的數量超過了肝鐵儲積的作用，提示尚有其它的途徑參與肝細胞凋亡。
酒精導致得肝損傷被認為與氧化應激導致的活性氧中間產物有關。在急性酒精中毒導致谷胱甘肽缺乏的大鼠模型中可見到許多凋亡的肝細胞。伴隨著氧化應激在酒精導致得肝損傷中的作用，抗氧化劑在同一動物模型中可以減少凋亡細胞的數量。活性氧中間產物和脂質過氧化的形成被認為與細胞色素P450 2E1(CYP2E1)有關，而CYP2E1在肝細胞內大量表達。在導入CYP2E1表達的肝細胞中，由活性氧中間產物介導的脂質過氧化和隨后在那些富含花生四烯酸的肝細胞中可見到細胞凋亡。同樣通過導入Bcl-2可以阻止由CYP2E1介導的肝細胞凋亡。另一研究在有明顯炎癥和脂質過氧化的實驗性ALD模型中發現Bcl-2 蛋白表達增加。因此肝細胞通過表達抗凋亡的Bcl-2蛋白可能是其抵抗酒精誘導的肝損傷的一種保護機制。
氧化應激也被認為與Fas系統相關，在酒精性肝損傷的病人中，肝細胞Fas配體mRNA轉錄增多，體內Fas配體可能是由活性氧中間產物誘導產生的。由于肝細胞可表達Fas受體，這些發現提示肝細胞可能通過旁分泌或自分泌的機制來介導自身的死亡。這種由酒精誘導肝損傷的潛在尚未完全闡明的重要機制被稱為“fractricide”.
其它的幾種細胞因子也可以參與酒精導致的細胞凋亡。纖維原性生長因子，轉化生長因子(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)可誘導培養的肝細胞發生凋亡，在ALD的進展中可能具有雙重作用：1）促進纖維化，2）通過凋亡殺死細胞。另外TNF-α1活性在臨床ALD病人中和實驗性ALD大鼠的肝細胞中表達均增強。慢性酒精消耗也可使肝細胞TNF-α1表達增加。總之，在慢性酒精消耗TNF-α1表達上調使肝細胞易于發生由這些細胞因子誘導的細胞凋亡，提示TNF-α1在ALD發病的病理生理中其重要作用。( 以上參考文獻2，6，12，13，14，15，16，17)
2 病毒性肝炎
研究表明肝細胞凋亡在病毒性肝炎中起重要作用。病理形態學研究表明人肝炎中的確存在死亡的凋亡細胞，事實上在病毒性肝炎中可以經常觀察到肝細胞以凋亡的行式被清除掉，病毒感染伴隨凋亡被認為是由細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）作用的結果。CTL在識別病毒抗原是誘導自身表達Fas配體，并與靶細胞表面的Fas結合，啟動凋亡信號，活化細胞死亡程序，使細胞死亡。已有的資料提示有幾種不同的凋亡通路參與了肝細胞的凋亡，包括Fas系統、TNF-α系統、Perforin/Granzyme系統。
對于細胞凋亡在病毒性肝炎中的作用僅有有限的資料。小樣本的資料研究表明在三例爆發性乙型病毒性肝炎中Fas蛋白表達增多。TUNEL分析表明大多數肝細胞呈陽性，提示Fas系統介導的凋亡參與急性肝炎的發病。
HBV和HCV是慢性肝病的主要致病因素。這些病毒感染使肝細胞易于發生凋亡，也可以通過model和病毒蛋白抑制凋亡。例如在小鼠肝細胞系中，TNF-α只能誘導高度表達HBV的肝細胞發生廣泛的凋亡。感染HBV的肝細胞對促進凋亡因素的敏感性增高被認為與HBV的X-基因產物有關；同樣HCV感染的肝細胞，HCV的病毒核心蛋白可以與TNF-αR1的胞漿內區域結合，這種相互作用在小鼠和人肝細胞株均可通過TNF信號轉導系統介導而促進肝細胞凋亡。HBV、HCV感染肝細胞凋亡的敏感性增高的機制是不十分清楚的，但可能與TNF-αR1表達上調無關。為了完成自身的復制和阻止感染的肝細胞被清除，病毒同時發展了阻止凋亡的機制，這可以從HCV的NS3蛋白可抑制放線菌素誘導的肝細胞凋亡中得到例證。病毒蛋白對凋亡的總體作用似乎與凋望刺激物、細