實驗概要
本實驗介紹了一種構建植物表達載體的方法。
實驗步驟
1. 植物正義表達載體的構建
1) 用SmaI和SacI雙酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表達載體pBI121：
2) 進行瓊脂糖凝膠電泳，回收GhMT3a片段和pBI121載體；
3) 連接：連接體系為：
混勻后4-160C連接過夜；
5) 轉化：取5ul連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，菌液涂布于含卡那霉素的固體LB平板上；
6) 重組子的篩選：對長出的菌落進行PCR及酶切鑒定。
2. 農桿菌感受態細胞制備及轉化
感受態細胞的制備：
1) 挑取農桿菌GV3101單菌落，接種于5m1LB液體培養基中，28℃，過夜培養；
2) 取2 ml培養物至液體LB中，繼續培養至OD600為0.5左右；
3) 將培養物冰浴30 min，4℃，5000 rpm，離心5 min；
4) 棄上清，10 ml 0.1 M冷NaCl懸浮菌體，4℃，5000rpm，離心5 min；
5) 棄上清，1 ml 20 mM冷CaCl2懸浮，分裝成200ul/管，液氮中冷凍后-80℃保存。
凍融法轉化農桿菌：
1) 冰上融化感受態細胞，加入1-2ul重組質粒DNA，冰浴45 min，液氮中冷凍1 min再37℃水浴5 min；
2) 加入1 ml無抗生素的LB，28℃，200 rpm，3 h；
3) 12000 rpm，離心1 min以濃縮菌液，100ul回溶菌體；
4) 將菌液涂于含有50 mg/l卡那霉素的固體LB培養基上，28℃，培養2-3 d ；
5) 通過菌落PCR篩選陽性克隆。
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