潔凈室沉降菌測試標準操作規程

1目的：建立潔凈室中沉降菌的測試標準操作規程，保證藥品在規定潔凈級別內進行生產。
  2范圍：潔凈室的沉降菌的監測。
  3依據：國家標準GB/T 16294-1996。
  4職責：QA潔凈度監測人員、微生物檢驗人員對本制度的實施負責。
  5內容
  5.1潔凈室：對塵粒及微生物污染規定需進行環境控制的房間或區域。
  5.2潔凈工作臺：一種工作臺或者與之類似的一個封閉圍擋工作區。其特點是自身能夠供給經過過濾的空氣或氣體，如垂直層流潔凈罩、水平層流罩、垂直層流潔凈工作臺、水平層流潔凈工作臺、自凈器等。
  5.3潔凈度：潔凈環境內單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑懸浮粒子的允許統計數。
  5.4菌落：細菌培養后，由一個或幾個細菌繁殖而形成的一細菌集落，簡稱CFU。通常用個數表示。
  5.5測試方法
  5.5.1方法概述：本測試方法利用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿，經48小時以上培養，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落數，來評定潔凈環境內的活微生物數，并以此來評定潔凈室的潔凈度。
  5.5.2所用的儀器和設備
  5.5.2.1高壓消毒鍋：使用時參照文件GZ-ZL-SOP-066-00進行操作。
  5.5.2.2恒溫培養箱：必須定期對培養箱的溫度計進行檢定。
  5.5.2.3培養皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培養皿。使用前將培養皿置于121℃濕熱滅菌20分鐘。
  5.5.2.4培養基：普通營養瓊脂培養基。將培養基加熱熔化，冷卻至約45℃在無菌操作條
  件下將培養基注入培養皿，每皿約15m1。待瓊脂培養基凝固后，將培養基平皿放入30～35℃恒溫培養箱中培養數小時，若培養基平皿上確無菌落生長，即可供采樣用，制備好的培養基平皿應在2～8℃的環境中存放。
  5.5.3測試步驟
  5.5.3.1采樣方法：將已制備好的培養皿放置在預先確定的取樣點，打開培養皿蓋，使培養基表面暴露0.5小時，再將培養皿蓋上蓋后倒置。
  5.5.3.2培養：全部采樣結束，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養。在30～35℃培養，時間不少于48小時。每批培養基應有對照試驗，檢查培養基本身是否污染，可每批選定3只培養皿作對照培養。
  5.5.3.3菌落計數：用肉眼直接計數，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養皿上有2個或2個以上菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數。
  5.6注意事項
  4.6.1測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。
  5.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。
  5.6.3對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。
  5.6.4由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養基沉淀物的區別，必要時用顯微鏡鑒別。
  5.6.5采樣前應仔細檢查每個培養皿的質量，如發現變質、破損或污染的應剔除。
  5.7測試規則
  5.7.1測試狀態
  5.7.1.1沉降菌測試前：被測試潔凈室（區）的溫濕度須達到規定的要求，靜壓差、必須控制在規定值內。被測試潔凈室（區）已消毒。
  5.7.1.2測試狀態有靜態和動態兩種，并在報告中注明測試狀態。
  5.7.1.3測試人員：測試人員必須穿戴符合環境潔凈度級別的工作服。靜態測試時，室內測試人員不得多于2個人。
  5.7.2測試時間
  5.7.2.1對單向流，如100級凈化房間內及層流工作臺，測試應在凈化空調系統正常運行不少于10分鐘后開始。
  5.7.2.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統正常運行不少于30分鐘開始。
  5.8沉降菌計數
  5.8.1最少采樣點數目：可按表1確定。在滿足最少測點數的同時，還宜滿足最少培養皿數，見表2。
  表1 最少采樣點數目
  面積(m2)  潔凈度級別
    100  10000  100000  300000
  ＜10  2～3  2  2  2
  ≥10～＜20  4  2  2  2
  ≥20～＜40  8  2  2  2
  ≥40～＜100  16  4  2  2
  ≥100～＜200  40  10  3  3
  注：表中的面積對于單向流潔凈室是指送風面積，對于非單向流潔凈室是指房間面積。
  表2 最少培養皿數
  潔凈度級別  所需Φ90mm培養皿數（以沉降0.5小時計）
  100  14
  10000  2
  100000  2
  300000  2
  5.8.2采樣點的布置：工作區測試點位置離地0.8～1.5m左右（略高于工作面）。可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加測點，采樣點的布置應力求均勻，避免采樣點在某
  局部區域過于集中，某局部區域過于稀疏。
  5.8.3記錄：測試報告中應記錄房間溫度、相對濕度、壓差、測試狀態及測試數據。
  5.8.4結果計算：用計數方法得出各個培養皿的菌落數。平均菌落數的計算見下式：
  m1+m2+……+mn
  平均菌落數m=n
  式中：m為平均菌落數；m1為1號培養皿菌落數；m2為2號培養皿菌落數；mn為n號培養皿菌落數；n為培養皿總數。
  5.8.5結果評定：用平均菌落數判斷潔凈室的空氣中的微生物。
  5.8.6潔凈室（區）內的平均菌落數必須低于所選定的評定標準（見表3）。
  5.8.7若某潔凈室（區）的平均菌落數超過評定標準，則必須對此區域先行消毒，然后重新測試兩次，測試結果必須合格。
  表3
  潔凈級別  100級  10000級  100000級  300000級
  標準（平均）  1個/皿  3個/皿  10個/皿  15個/皿

  主要參考文獻：國家標準GB/T 16294-1996