實驗材料 動物組織
試劑、試劑盒 乙酸緩沖溶液葡萄糖醛酸酶蛋白酶氫氧化鉀溶液三氯乙酸甲基叔丁基醚-環己烷
儀器、耗材 離心管培養箱超聲水浴硅烷化梨形瓶色譜柱
實驗步驟
1. 樣品提取
取充分均質的組織樣品10 g于100 mL玻璃離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸緩沖溶液，20 mg葡萄糖醛酸酶和蛋白酶，于均質器上均質1 min，置于培養箱中60培養1 min。冷卻后加入15 mL 200 g/L三氯乙酸（采用廣范圍試紙，調pH1.5），在超聲水浴上超聲10 min。將提取液于10/15 ℃，4000 g離心15 min，若仍然存在懸浮物，溫度可降低至8 ℃。傾出上清液，用20%氫氧化鉀溶液調整pH至5.8～6.2，若在中和過程中出現沉淀，應進行過濾或再次離心。用200 g/L三氯乙酸淋洗電極，并入溶液中，并使總體積接近500 mL。移取20 mL 上述溶液于ISOLUTE HM-N柱中，平衡20 min。制備兩份20 mL溶液，每份加入30 mL甲基叔丁基醚-環己烷（8 + 2），于100 mL硅烷化梨形瓶中，減壓250 mbar，50 ℃旋轉蒸發至干。
2. 凈化
將ISOLUTE-Si汾置于SPE裝置上，預先按順序加4 mL乙酸乙酯，4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80），抽干。用2 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）溶解殘渣，超聲振蕩，轉移入柱。然后以4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）淋洗，棄去淋洗液。用4 mL乙酸乙酯-甲苯（65 + 35）洗脫并收集氯霉素組分。
2. 衍生化
收集溶液于40 ℃在緩慢氮氣流下吹干。用200 uL乙酸乙酯轉移入反應小瓶，加入20 uL內標溶液m-CAP，再次于40 ℃在緩慢氮氣流下吹干。加入50 uL BSTFA-TMCS（99 + 1）溶液，用內襯聚四氟乙烯（PTFE）的螺旋蓋蓋緊，于60 ℃反應l h。冷卻后，在氮氣流下緩慢吹干。加入25uL異辛烷溶解殘渣。供GC-MS測定。
3. 儀器條件
色譜柱：5%苯基、95%甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25um；
柱溫：程序升溫，60 ℃（l min），以40 ℃/min，升至 l80 ℃ ，以8 ℃/min， 升至280 ℃，以5 ℃/min，升至300 ℃；
進樣方式：脈沖，無分流；
進樣器溫度: 270 ℃ ；
載氣：氦氣；
接口溫度：300 ℃；
離子源溫度：l85 ℃；
NCI離子化模式；
反應氣：甲烷，壓力為533 Pa（4000mTorr）；
碰撞氣：氬氣，壓力為0.27 Pa（2mTorr）；
電子能量: 200 eV；
碰撞電流: 200 mA；
CAP：m/z 466（70）、468（70）、376（30）、378（30）；
內標：m/z 47l（70）。