液相色譜－串聯質譜法測定強化食品中葉酸的含量

方案優勢

該方法在0.05～100 ng/mL 濃度范圍內線性關系良好，定量下限為0.01～0.5 mg /kg，回收率為72.0%～109%，相對標準偏差(RSD) 為3.8%～11.8%。該方法簡單快速，靈敏度、準確度和精密度均能滿足強化食品中葉酸的測定要求。

采用標準

相關標準

方法/原理/步驟

　　樣品前處理(下述提取步驟，均須避光進行。)

　　1.果汁飲料稱取2g試樣于10mL容量瓶中,加入40μL 50μg /mL內標液(甲氨蝶呤)和100μL1mg/mL BHT溶液，用水定容至刻度后過膜待測。

　　2.大米、果凍、餅干稱取2g試樣于10mL容量瓶中，加入40μL50μg/mL內標液和100μL 1mg/mL BHT溶液，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度，渦旋混勻1min，超聲15min，4000 r /min離心10 min，過膜待測。

　　3.含乳飲料稱取2g試樣于10mL容量瓶中，加入40μL50μg/mL內標液和100μL 1mg/mL BHT溶液，用4%三氯乙酸溶液溶解并定容至刻度，渦旋混勻1min，超聲15min，4000 r/min離心10min，過膜待測。

　　4.奶粉稱取5g試樣于離心管中，加入200μL50μg/mL內標液和500μL1 mg/mL BHT溶液，用25mL45～50℃水溶解并渦旋混勻1 min，超聲15 min。待溶液溫度降至室溫后，用5 mol/L鹽酸溶液調節至pH 1.90±0.5，放置2min，再用5mol/L氫氧化鈉溶液調節至pH 4.7±0.5。將溶液轉移至50mL容量瓶中，用水定容至50mL，超聲10min，4000r/min離心10min，過膜待測。

　　儀器條件

　　1.色譜條件

　　Waters HSS T3色譜柱( 50 mm×2. 1 mm，1.7μm) ;進樣量5μL;柱溫30℃;流動相:A為10 mmol /L乙酸銨( pH 6. 3)水溶液，B為甲醇;梯度洗脫程序: 0～1 min保持B為1%;1～4min，B從1%升至55%; 4～6 min保持B為55%; 6～6.1 min，B降至1%; 6.1～10 min保持B為1%。

　　2.質譜條件

　　大氣壓電噴霧離子源，正離子電離模式。毛細管電壓3.5kV;噴霧壓力45psi;氣簾氣流量5L/min;鞘氣流量10L/min;鞘氣溫度350℃;毛細管溫度350℃;定性離子對: m/z442.4→176.9，碰撞能量33eV;定量離子對m/z 442.4→295.1，碰撞能量21eV;甲氨蝶呤m/z 445.0→308.0，碰撞能量20eV。

　　結果與討論

　　1.基質及內標物的選擇

　　依據GB14880-2012《食品安全國家標準食品營養強化劑使用標準》，按照可強化食品的不同類別選擇并確立6種代表性食品:果汁、奶粉、含乳飲料、大米、餅干和果凍。

　　通過大量查閱國內外文獻，選取D4-煙酸、D4-煙酰胺、乙酰苯胺、馬尿酸、甲氨蝶呤及33C5-葉酸放射性同位素內標等6種內標，對其安全性及定量結果的準確性進行比較，最終選擇甲氨蝶呤作為內標物。

　　2.葉酸的穩定性實驗

　　葉酸在酸性溶液中熱不穩定，在堿性溶液中易被氧化，水溶液遇光迅速分解，因此需要通過控制溶液所處的環境改善葉酸儲備液的穩定性。分別用水、1%氨水、5mgVc、0.01 mol/LHCl(pH 2.0)、0.01mol/L HCl(pH 5.0)、25μLβ-巰基乙醇、1%BHT、10 mmol /L乙酸銨和3%偏磷酸等不同溶劑配制濃度為100μg/mL的標準溶液，并將配制好的溶液用鋁箔做避光保護，4℃冰箱中儲存。測試不同溶劑不同時間段的峰面積并進行比較，得到葉酸的穩定性曲線圖

葉酸的穩定性曲線圖

　　由圖可知，葉酸在強酸條件下容易分解，當采用0.01 mol/L HCl(pH 2.0)和3%偏磷酸作為溶劑時，葉酸標準溶液分解現象十分明顯;采用水、0.01 mol/LHCl(pH =5.0)和10mmol /L乙酸銨作為溶劑時，溶液在16h內穩定性較好，基本無分解，16～48h出現緩慢分解，48h后分解現象十分明顯;當采用1%氨水溶解葉酸時，1～4d內無分解，在第5d分解了10%，因此葉酸標準儲備液在1～4d內具有良好的穩定性，能夠滿足定量分析實驗要求。同時，比較了Vc、β-巰基乙醇和BHT 3種抗氧化劑的抗氧化效果，發現添加BHT的溶液在72 h內基本無分解，因此樣品前處理過程中加入BHT，能夠避免葉酸的氧化，有利于穩定性的提高。

　　二丁基羥基甲苯( BHT)的優化

　　由于葉酸的不穩定性，實驗過程中需要加入BHT避免葉酸的氧化。用0.01 mol/L HCl溶液配制濃度為100μg/mL的儲備液，常溫下放置12h后，比較了不同質量分數BHT溶液(0.1%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%，1.5%，2.0%)對葉酸穩定性的影響。對新配制的葉酸儲備液進行檢測，此時得到的峰面積數據認為無損失，記為100%;然后分別取含不同濃度BHT的葉酸溶液進行檢測，得到各標準儲備液的峰面積，將此峰面積與新配制溶液得到的峰面積進行比較;以BHT含量為橫坐標，百分比為縱坐標，得到各標準儲備液的穩定性數值如圖。結果發現，隨著BHT用量的增多，葉酸的分解速度變慢，穩定性提高，但當達到1%時，溶液中的葉酸趨于穩定，因此實驗選取加入1%的BHT作為抗氧化劑。

BHT 使用量對反應的影響

儀器設備

高效液相色譜儀

高效液相色譜儀的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中做相對運動時，經過反復多次的吸附- 解吸的分配過程，組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。