淋巴細胞轉化試驗（MTT）

（一）原理：
四甲基偶氯唑鹽（MTT）可作為線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物。當有活細胞存在時，線粒體內琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成紫蘭色的甲臢，將結晶的甲臢溶解釋放后，可根據所測的OD值反映活細胞的數量和活性，從而推知待測樣品的水平。

（二）材料：
MTT、電子天平、PBS液、二甲基亞砜、無菌針頭過濾器、細胞計數板、臺盼蘭、無菌操作臺，CO2培養箱，酶標儀，－20℃冰箱。用稱取50mg的MTT，溶于10ml后，終濃度為5mg/ml，過濾除菌，無菌EP管分裝，－20℃避光保存。絲裂原：PHA、ConA、PWM或其他絲裂原

（三）方法：
1、脾細胞制備：
（1）小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡3分鐘，取出小鼠置于無菌紙上，左腹側朝上；
（2）在小鼠左腹側中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟；
（3）在脾臟下側提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離脾臟下面的結締組織，取出脾臟。放入盛有5ml Hanks液的培養皿中；
（4）制備脾細胞懸液
①鋼網研磨法：無菌取脾，將脾臟放置不銹鋼網（100或200目）上，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，制成單細胞懸液；經200目篩網過濾，用Hanks液洗3次，每次離心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀釋后在細胞計數板上進行細胞計數，并用臺盼蘭染色(0.1ml0.6%臺盼蘭+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml細胞懸液，混勻)，計算細胞存活率(應在95％以上)。調整細胞濃度為5×105/ml。
②梳刮法：脾臟可用鑷子輕輕梳刮，避免將脾臟弄成碎片，將細胞懸液吸入離心管中，自然沉降5分鐘，將懸液移至另一離心管中，棄去較大的組織塊，離心沉淀細胞；
③酶消化法：將脾臟用鑷子夾碎，加入400u/ml膠原酶（III型）5ml/只脾臟，37度消化20分鐘，用尼龍網過濾，得到單細胞懸液。
注：①一般6～8周齡小鼠，根據品系不同，可得5～20×107細胞/只小鼠；
②手術器械滅菌：術前高壓滅菌外，也可將手術器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精燈上燒灼去除酒精，即可保證無菌，此法較為簡便。
2、淋巴細胞增殖反應：
將5×105/ml脾細胞懸液加入到96孔培養板中，200ul/孔，每一份脾細胞懸液分裝3n個孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3個孔不加ConA作為對照。置5％CO2，37℃培養48-72h，在培養結束前4-6小時，于培養板各孔內加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。37℃培養4-6小時。
4. 1000g離心10分鐘棄上清，各孔內加入150μlDMSO，溶解10min，30分鐘內（或加2%SDS 100ul/孔，過夜。或干燥后，各孔內加入0.01M鹽酸—異丙醇100ul）用酶標測定儀測OD值，測定波長570nm。
實驗結果
將實驗組和對照組三個復孔的OD值平均。
轉化值=實驗組的平均OD值-對照組的平均OD值。
注意事項
（1）由于本實驗需要培養3天，才能觀察結果。因此，在操作時應注意無菌操作，避免細菌污染，導致實驗的失敗。
（2）細胞操作要輕柔、迅速，以免細胞損傷影響實驗結果。