溫度和時間對酶水解豆粕效果的影響研究

目前動物性蛋白原料價格上漲，導致了對高品質植物性蛋白質需求量的增加。在世界范圍內，飼料中的絕大部分蛋白質來自油料種籽和豆科作物等植物性蛋白，豆粕又是應用最廣泛的植物飼料蛋白質資源，其蛋白質含量高，除富含蛋氨酸外，其它氨基酸也較平衡，但是由于大豆中存在一些抗營養因子，如抗胰蛋白酶因子、抗原蛋白，嚴重影響飼料蛋白源的生物學效價，從而限制了其在早期斷奶仔豬和犢牛日糧中的應用。許多國家用熱乙醇處理、膨化加工處理等方法去除大豆抗原，但這些處理方法成本高，安全性差，污染大，不宜推廣。采用生物酶制劑對豆粕進行處理，條件溫和，綠色安全。它通過破壞大豆抗原蛋白質的高級結構，從而達到破壞其抗營養因子的作用，提高仔豬對飼料的利用率。
1 材料與方法
1.1 材料
豆粕（CP 48.165％）、中性蛋白酶（無錫市某公司提供）。
1.2 測定指標
氨基氮含量（mg/g）的測定參照黃偉坤(1989)的方法進行；蛋白質水解度（DH％）的測定參照趙新淮等(1995)的方法進行。
1.3 中性蛋白酶水解條件的確定
1.3.1 最適溫度的確定
中性蛋白酶使用的穩定pH值范圍為6.5～7.5，取初始pH值為7.5，故安排試驗如下：豆粕碎過120目篩，取1 g豆粕加水10 ml按照固液比(1：9，其中8 ml緩沖溶液，1 ml酶液)，加酶量E/S=1%(質量百分比)，分別在320、370、420、470 ℃水解30 min后，沸水浴加熱10 min，離心10 min，取上清液過濾，定容至100 ml，取樣測氨基氮含量。
1.3.2 最適水解時間的確定
樣品處理同上，在確定的最適溫度下，pH值為7.5，加酶量(E/S)為1%，取水解時間分別為3、4、5、6 h，沸水浴加熱10 min，離心10 min，取上清液過濾，定容至100 ml，取樣測氨基氮含量。

1.4 統計分析
用Excel對數據進行初步處理，以SPSS13.0統計軟件對數據進行回歸分析，LSD法進行多重比較。
2 實驗結果
2.1 酶水解溫度的確定（見表2、圖1）

由表2、圖1的實驗數據表明，中性蛋白酶隨溫度的提高，水解活性逐漸增強，達到42 ℃時，相同時間內產生氨基氮的量和蛋白質被酶水解程度最大，以后隨溫度的提高，中性蛋白酶的水解活性明顯降低。在42 ℃條件下水解產生氨基氮的量比32、37 ℃條件下水解產生氨基氮的量分別提高了76.78%(P<0.01)和56.77%(P<0.01)；而在47 ℃條件下比42 ℃時減少了60.94%(P<0.01)。實驗還表明，在42 ℃條件下蛋白質被酶催化水解的程度比在32、37、47 ℃時分別高出1.23、1.03、1.73個百分點。用二次回歸曲線求出最適水解溫度為41.36 ℃（R2＝0.999 7）。
2.2 酶水解時間的確定（見表3、圖2）

由表3、圖2結果表明，隨酶水解時間的延長，氨基氮的產生量逐漸增加，蛋白質被酶水解程度逐漸提高，4 h比3 h提高了22.03%(P>0.05)，5 h比4 h提高了9.19%(P>0.05)，6 h比5 h提高了1.30%(P>0.05)，它們的變化幅度逐漸減小,但水解6 h時氨基氮的平均產生量比3、4 h時分別提高了34.97%(P<0.01)和10.59%(P>0.05)。蛋白質被酶催化水解的程度5 h比3、4 h時分別高出2.49和0.85個百分點，比水解6 h下降0.13個百分點。由此表明，水解效果隨時間的延長并不是呈線性上升的關系，達到一定程度氨基氮的產生將停止。結合水解效率和實際生產運用，水解時間5 h左右為宜。
3 討論
3.1 溫度對酶解效果的影響
大多數化學反應的速率都和溫度有關，酶的催化反應也不例外。每種酶在一定條件下都有其最適溫度。實驗結果表明，中性蛋白酶在反應的最初階段，酶蛋白的變性尚未表現出來，因此產生氨基氮的量隨溫度升高而增加，但高于42 ℃時，酶蛋白變性逐漸突出，反應速率迅速隨溫度升高的效應逐漸被酶蛋白變性效應所抵消，氨基氮產生量下降。中性蛋白酶在42 ℃水解豆粕產生氨基氮的量極顯著高于其余溫度下的產生量(P<0.01)，即產生的氨基氮最多，酶的水解活性最高，說明溫度的高低對酶活性的影響相當大。根據二次回歸曲線求出在此實驗條件下中性蛋白酶適合反應溫度是41.36 ℃(R2=0.999 7)。李磊等(2002)對大豆餅粕進行中性蛋白酶水解處理的最適溫度為40 ℃。李樹品等(1997)做了應用中性蛋白酶對豆粕進行水解的實驗，確定pH值為7.0、溫度為45 ℃為最適水解條件。產生溫度差異的原因可能是：①豆粕所過目篩不同，酶與底物結合后造成酶活性中心結構的改變影響其催化活性；②水解反應過程中pH值的變化造成的。從仔豬實際生產角度考慮，初生仔豬的體溫在39.5 ℃，所以，在仔豬體內中性蛋白酶接近它的最適反應溫度，能夠一定程度上發揮酶的最大水解活性，在此溫度條件下，中性蛋白酶的活性較高，能夠一定程度的水解蛋白質、破壞大豆抗原蛋白的高級結構，從而破壞抗營養因子，提高飼料蛋白質的利用率，降低仔豬腹瀉。對于消化酶分泌不足的幼齡動物通過添加生物酶制劑可以增加消化酶的種類和數量，提高其對各種物質的消化和吸收。
3.2 時間對酶解效果的影響
中性蛋白酶水解豆粕產生氨基氮的量隨水解時間延長而逐漸增大，但水解到5 h后，氨基氮產生速度減緩，水解6 h產生氨基氮的量極顯著高于水解3 h產生氨基氮的量(P<0.01)，該結果與龍定彪(2004)、呂剛等(2005)的實驗結果相同；水解度與呂剛等(2005)的實驗結果相同。考慮到隨水解時間延長，底物不斷消耗，其濃度逐漸降低，酶也逐漸失活；另外生成的產物在釋放出來之前與酶以復合體形式存在，可以占領酶分子上的特殊位點，使酶不能結合底物，產生競爭性抑制；或者占據催化部位，對結合了的底物不能發揮催化作用。所以達到一定程度后水解速度必然隨之減慢。由于飼料在仔豬小腸中停留的時間為4～5 h，在這段時間內，中性蛋白酶能夠和底物充分結合，使肽鍵破裂，降解大豆抗原蛋白成為氨基酸或者多肽，這樣有利于小腸的吸收和利用，減少氮的排泄，降低養豬業的環境污染，同時生產出無藥物殘留，有利于人類健康的安全肉產品。但水解時間太長，酶水解效率達到一個平臺期，氨基氮產生量和水解度沒有顯著變化（P>0.05），而且食糜在5 h后將進入大腸，不利于仔豬的消化吸收。
4 結論
中性蛋白酶水解豆粕在pH值7.5、酶用量(E/S)為1%、固液比為1：9時的最適水解溫度為41.36 ℃，水解時間為5 h左右。