1 前言
有機磷和氨基甲酸酯類農藥是果蔬種植中最常用的殺蟲劑。此類農藥的毒理機制為抑制人和動物體內膽堿酯酶的生理活性，使神經傳導受阻，致使人和動物神經麻痹乃至死亡。
除了使用農藥殘留速測儀外采用酶抑制率法檢測農藥殘留是目前我國控制農殘超標的果蔬流入市場的最常用的快速檢測方法。在這個技術中，酶試劑的性能是技術關鍵。從不同酶源中提取的膽堿酯酶，對不同的農藥的敏感度是不同的。據文獻報道，雖然膽堿酯酶試劑對多數有機磷和氨基甲酸酯類農藥的靈敏度可在0.
01~10Lg/ml左右[1~3],但對國家明令禁止在果蔬上使用的高毒農藥如甲胺磷、氧樂果等農藥其殘留卻要達到幾個甚至幾十Lg/ml才能檢出，而在我國由于高毒農藥甲胺磷，氧樂果等價格低殺蟲效果好而被果農菜農所濫用情況仍嚴重存在，如果膽堿酯酶試劑對這些農藥的檢測靈敏度低，則無法有效控制甲胺磷、氧樂果等高毒農藥超標的果蔬流入市場。
本文介紹我們研制的膽堿酯酶試劑對甲胺磷、氧樂果的檢測靈敏度達到[0. 3Lg/ml的水平，同時對其它常見的農藥的檢測靈敏度也達到[0. 5Lg/ml。
2 實驗部分：
2. 1 酶源的篩選：
各種動物的肝、血清、腦部、肌肉中都含有豐富的膽堿酯酶，許多植物中的酶也可用于酶抑制率法檢測農藥殘留。目前各種蜂的頭部、果蠅頭部、敏感家蠅頭、豬肝、牛肝、鼠肝、兔血清、黃鱔血、馬血清、鴨血清等作為酶源均有應用[4]。我們選擇了六十余種動物酶源和淀粉類植物酶源，以甲胺磷、氧樂果作為目標進行比較篩選。
2. 1. 1 膽堿酯酶粗提液的制備：
a.動物肝臟：棄去筋，膜和脂肪，切碎后用1份肝臟和3份冰蒸餾水制成勻漿，漿液用細紗布過濾得到濾液，濾液于離心機上以4000轉/分離心50分鐘，上清液置于冰箱中備用。
b.動物的血清：將剛抽出的動物血液注入無抗凝劑容器中，在室溫下使血液凝固后，置于冰箱中充分冷凍，然后離心分離凝塊取上清液儲藏于冰箱中備用。
c.昆蟲類酯酶：昆蟲分別加入0）4e緩沖液，正丁醇及適量的牛磺酸后，放入勻漿器中勻漿60分鐘。漿液用細紗布過濾得濾液。于離心機上離心50分鐘（4000轉/分）。離心得到的上清液置于冰箱中備用。
d.動物的肌肉；棄去筋，膜和脂肪，切碎后用1份肌肉和5份0）4oC的緩沖液制成勻漿，漿液用細紗布過濾得到濾液，濾液于離心機上以4000轉/分離心50分鐘，上清液置于冰箱中備用。
e.植物淀粉：取適量的新鮮食用面粉，加入250ml的蒸餾水，振蕩30分鐘后，靜置30分鐘以上，取上清液經4000轉/分離心50分鐘后，收集上清液為酶粗提液，置于冰箱中備用。
2. 1. 2 對甲胺磷、氧樂果敏感度的考察方法：
用DTNB法（硫代乙酰膽堿-聯硫代雙硝基苯甲酸法）測定酶粗提液的活性，并將所制的各種酶粗提液的活性調整到基本一致后，采用酶抑制率法考察不同濃度的甲胺磷、氧樂果對各種酶源粗提液的抑制效果。
2. 1. 3 酶源篩選的測試結果比較：
表1 不同酶源的酶粗提液對甲胺磷農藥的敏感度：
表2 不同酶源的酶粗提液對氧樂果農藥的敏感度： 由表1和表2實驗數據可知當甲胺磷和氧樂果農藥的濃度達到1.
26）5.
1Lg/ml時，敏感家蠅、馬血清、小牛血清和平腹小蜂的膽堿酯酶粗提液才反映出一定的敏感度，而且需要的抑制時間較長。而酶源（II）的酶粗提液對甲胺磷和氧樂果的敏感度較好，在較短時間內對0.
5Lg/ml的甲胺磷和氧樂果就可以達到57%和45%的抑制水平。 表4 不同酶源制備的膽堿酯酶試劑對氧樂果農藥的靈敏度： 2. 3. 3 綠T酶（Ⅱ）試劑對幾種常用農藥的檢測曲線：
2. 2
酶粗提液的提純、活化由于酶粗提液中不但含有大量的脂肪、雜蛋白等干擾物質，而且還有其它的酯酶存在，其中有些酯酶如脂族酯酶就可以作為膽堿酯酶抑制劑的替代靶標，它們的存在大大影響膽堿酯酶對農藥殘留的檢測，也降低檢測的靈敏度。我們對酶粗提液進行了提純活化處理，優化其對不同農藥的選擇性和敏感度，從整體上提高對有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測靈敏度。
2. 2. 1 酶粗提液的提純方法：
采用硫酸胺分級沉淀法，確定并收集有效活性成分，將收集的沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，并在預先用磷酸鹽緩沖液平衡過的層析柱上洗脫，收集有效的酶活性成分。
2. 2. 2 膽堿酯酶活化處理：
往經過層析柱洗脫收集到的有效活性成分中加入酶活化劑，攪拌令其充分反應后置冰箱中放置一定的時間再加入保護劑即得膽堿酯酶試劑。
2. 3 膽堿酯酶試劑對有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測性能：
2. 3. 1 不同酶源制的膽堿酯酶試劑對甲胺磷、氧樂果農藥的檢測靈敏度：
經過上述處理后的各種膽堿酯酶試劑對甲胺磷、氧樂果的檢測靈敏度均有了提高，此時由酶源（Ⅱ）制備的膽堿酯酶僅10分鐘的抑制時間對甲胺磷、氧樂果的檢測靈敏度即可達到≦0. 3Lg/ml（以酶抑制率50%計）。
表3 不同酶源的膽堿酯酶試劑對甲胺磷農藥的檢測靈敏度：
2.3. 2 酶源（Ⅱ）制備的綠T酶（Ⅱ）試劑對常用農藥的檢測靈敏度：
由表3表4可知，我們研發的綠T酶（Ⅱ）試劑僅需要10分鐘的酶抑制時間即可對甲胺磷，氧樂果達到≦0.
3Lg/ml的檢測靈敏度。在解決了甲胺磷，氧樂果檢測靈敏度的基礎上，我們還對多種常用的有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測靈敏度進行優化，使之對目前特別關注的難以解決的高毒農藥如甲胺磷、氧樂果、毒死蜱、二嗪農等都能達到靈敏度[0.
3Lg/ml的檢測水平。綠T膽堿酯酶（Ⅱ）試劑不僅大大提高了甲胺磷，氧樂果的檢測靈敏度同時對大部分的有機磷和氨基甲酸酯類的農藥的檢測靈敏度均可達到[0.
5Lg/ml。見表5。
表5 綠T酶（Ⅱ）試劑對常用的有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測靈敏度
按GB/T5009. 199）2003操作方法用不同濃度的農藥標準溶液與綠T酶（Ⅱ）試劑作用，測定抑制10分鐘的酶抑制率并制作出農藥濃度~酶抑制率的關系曲線。見圖1:
圖1綠T酶（Ⅱ）制劑對幾種常見農藥的檢測曲線
由以上幾種農藥濃度與酶抑制率的關系曲線可以看出，作用于膽堿酯酶試劑的農藥的濃度越高，其受抑制的情況愈嚴重，則酶抑制率就愈高。
3 綠T酶（Ⅱ）試劑應用于果蔬中農藥殘留的快速檢測：
目前膽堿酯酶（Ⅱ）已廣泛應用于果蔬中農藥殘留的快速檢測，我們用膽堿酯酶（Ⅱ）對福州市場上的72批38種果蔬樣品進行快速檢測同時用氣相色譜儀測定農藥殘留量進行比對。兩種方法的符合率為94%。
4 結論：
我們所研發的綠T酶（Ⅱ）試劑對高毒農藥甲胺磷，氧樂果有較高的檢測靈敏度（[0.
3），對大部分的有機磷和氨基甲酸酯類農藥均有較好的靈敏度，對常用農藥甲胺磷、氧化樂果、西維因、毒死蜱、久效磷、辛硫磷、呋喃丹、敵敵畏、敵百蟲、對硫磷、二嗪農、甲基對硫磷等均達到<0.
5Lg/ml的檢測水平；同時在實際應用中其檢測結果與氣相色譜有很好的符合性，是農藥殘留快速檢測中具有較高靈敏度的酶試劑。