《中國藥典》二部采用家兔法檢查熱原,將一定劑量的供試品靜脈注入家兔體內,在規定時間內觀察家兔體溫升高的情況,以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。給家兔注射一定量的熱原后,一般15～30分鐘體溫開始上升,70～120分鐘達到最高峰。檢查結果的準確性和一致性取決于試驗動物的狀況、實驗室條件和操作的規范性。
(一)試驗動物
熱原檢查的試驗動物為家兔,應符合:①健康合格,體重1.7kg以上,雌兔應無孕。預測體溫前7日應用同一飼料喂養,在此期間內,體重應不減輕,精神、食欲、排泄等不得有異常現象。②對未曾用于熱原試驗的家兔;或供試品判定為符合規定,但組內升溫達0.6℃的家兔;或3周內未曾使用的家兔均應在試驗前3～7日內預檢體溫,進行挑選。挑選試驗條件與檢查供試品時相同,僅不注射藥液,每隔30分鐘測溫1次,連續測4小時,共測8次。4小時內各兔體溫均在38.0~39.6℃,且最高最低溫差不超過0.4℃者,方可供試驗用。③凡熱原試驗用過的家兔,如供試品判為符合規定,至少休息48小時后可重復使用。其中升溫達0.6℃的家兔應休息2周以上。④如熱原檢查不合規定時,則組內全部家兔不能再使用。每一家兔的使用次數,用于一般藥品的檢查應不超過10次。
(二)檢查前的準備工作
實1.每批供試品初試用3只,復試用5只家兔。在檢查前1～2日,供試用家兔應分別為能處于同一溫度的環境中,實驗室和飼養室的溫度相差不得大于3℃,實驗室的溫度0.4℃、 在17～25℃,在試驗全過程中,應注意室溫變化不得大于3℃,應防止動物騷動并避免解聲干擾。
2.家兔在試驗前至少1小時開始停止給食,并置于寬松適宜的裝置中,直至試驗
完畢。測量家兔體溫應使用精密度為±0.1℃的測溫裝置。測溫探頭或肛溫計插人
的深度和時間各兔應相同,深度一般約6cm,間不得少于1分半鐘,每隔30分鐘測量體溫1次,一般測量2次,兩次體溫之差不得超過0.2℃,以此兩次體溫的平均值作為1兔的正常體溫。當日使用的家免,正常體溫應在38.0～39.6℃,且同組各兔間正常體肛門內之差不得超過1℃。
3.試驗用的注射器、針頭及一切和供試品接觸的器皿,應置烘箱中于250℃加熱2.分鐘,或用180℃加熱2小時,也可用其他適宜的方法除去熱原。
(三)檢查方法
1.測家兔正常體溫后15分鐘內,自耳靜脈緩緩注入規定劑量并溫熱至約38可采用供試品溶液,然后每隔30分鐘測量體溫1次,連續測6次。
2.每只兔的正常體溫與注射供試品溶液后6次測量體溫中最高的體溫之差即為該兔體溫的升高溫度。
(四)結果判定
1.符合下列情況者,判為符合規定在初試3只家兔中,體溫升高均低于0.6℃,并且3只家兔體溫升高總和低于1.3℃;或在復試的5只家兔中,體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超過1只,并且初試、復試合并8只家兔的體溫升高總和為3.5℃或3.5℃以下。
2.有下列情況之一者,復試一次3只家兔中1只體溫升高0.6℃或0.6℃以上;3只家兔升溫均低于0.6℃,但3只家兔升溫總和達1.3℃或1.3℃以上。
3.有下列情況之一者,判為不符合規定在初試3只家兔中,體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超過1只;或在復試的5只家兔中,體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超過1只;或在初試、復試合并8只家兔的體溫升高總和超過3.5℃。
4.出現負值的規定如下當家兔升溫為負值時,均以0℃計。
(五)注意事項
1.建議應盡量使用熱原測溫儀測溫,因為其感溫探頭在整個測溫過程中都置于兔門內,兔較安靜,所測體溫較正確,同時也避免了給藥后1小時、2小時、3小時測溫這項規定造成的漏檢現象。
2.熱原的耐熱性能良好,60℃加熱1小時不被分解破壞,100℃不降解,但180℃3-4小時、200℃60分鐘或250℃30～45分鐘可使熱原徹底破壞。因此耐熱物品如玻璃制品、金屬制品、生產過程中所用的容器和其他用具以及注射時使用的注射器等,均可采用此法破壞熱原。
3.熱原實驗室內外應保持安靜,避免強烈直射的日光或燈光及其他刺激。室溫應為17～25℃,且在全部試驗過程中,室溫變化不得大于3℃
4.有的供試品如腺苷三磷酸二鈉注射時要注意速度應緩慢,否則易造成家兔死亡。
5.試驗過程中,要及時填寫兔卡及原始記錄。