3.2.2 單噬菌體克隆的鑒定
( 1 ) 從單克隆中制備噬菌體（或噬粒)。對噬粒，在 2 ml LB-Ap 上過夜生長一單菌落。混合 20 μl 培養液、2 ml LB-Ap ( 和 IPTG，如愿意的話）和 1010 個/ml 輔助噬菌體 KO7。37°C 劇烈搖動保育過夜。對噬菌體克隆，用滅菌的牙簽接觸一單菌斑。將牙簽放在 2 ml 含 100 μl 新鮮 XL-1 Blue 的 LB-Ap ( 和 IPTG，如果需要的話）中，37°C 劇烈搖動保育 6 h。按 3.1.1 和 3.1.2 節所述，制備噬菌體（或噬粒)。
( 2 ) 對每一個要測試的克隆，完成 3.2.1 節的第 （1 ) 和第 （2 ) 步，來準備一帶有固定目標分子的小孔。同時用不含目標分子的涂漬溶液涂漬，來制備另一對照用小孔（見注6 )。
( 3 ) 加入 5 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 從單克隆制備的噬菌體懸浮液到配體涂潰的和對照的小孔中。視相互作用強弱，調節噬菌體濃度（典型值：每孔 108~1011 個）。在攪拌 器上室溫保溫 2 h。
( 4 ) 用 TBST 沖洗 5 次。用噴水瓶在所有小孔中加入 TBST，然后清除液體，將平板翻轉面朝下拍在一疊紙巾上。
( 5 ) 在每一個孔中，加入 50 μl 抗噬菌體-辣根過氧化物酶的抗體溶液（Phamacia; 在 TBST : BSA 中稀釋1 : 2000)， 在攪拌器上室溫保溫 1 h。用 TBST 清洗 5 次。
( 6 ) 加入 50 μl 1step turbo-TMB (Pierce) ，等待約 10 min 直到藍色顯現，并加入 50 μl 2 mol/L 硫酸以終止反應 （ 使用有濾嘴的槍尖以保護移液器）。用平板讀出器測量 OD450。選擇對配體涂漬的小孔有高親和力并對對照小孔呈低親和力的克隆，以備進一步檢測（測序、親和力優化和蛋白質生產）。
3.3 酵母雙雜交篩選
3.3.1 目標（“誘餌”）質粒的制備
在 pEG202 中克隆誘館基因，使得誘餌與 LexA 在同一可讀框表達。重要的是確認 LexA- 誘餌自己不激活報告基因，也不與野生型 FNfn10 相互作用。用相互作用交配法，這很容易測試 [13，19 ] 。
( 1 ) 用 LexA-誘餌質粒 [ 或 pEG202 作負對照，pBait (Origene) 作正對照 ] 和 pSH18-34 ( β-半乳糖苷酶報告質粒；Origene) 轉化 RFY206，并在 YC Glc his- ura- 平板上選擇。也 用 pYesTrp2 ( 激活子 B42 質粒；Invitrogen )、pTarget (正對照；Origene ) 或 pYT45 轉化 EGY48，并在 YC Glc trp-平板上選擇。
( 2 ) 在 YC Glc his-ura- 平板上兩個菌斑的每一個上用 LexA 質粒和報告質粒上平行劃痕。在 YC Glc trp - 平板用 B42 質粒以同樣的方式劃痕。30°C 保育兩塊平板 1~2 d。
( 3 ) 復制兩塊平板至一 YPD 平板。從兩塊板上來的劃痕應該互相垂直，以使 EGY48 細胞和 RFY206 細胞在交疊處雜交。30°C 保育過夜。
( 4 ) 將 YPD 平板復制至 YC Glc leu- his- trp - ura、YC Glc his- trp- ura- 和 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 平板，并在 30°C 保育 3 d。所有雜交細胞應該在 YC Glc his- trp - ura- 平板上生長。在 YC Gal Raf leu - his- trp - ura- 平板上的生長指示“誘餌”和 “捕食者” 的相互作用。其他平板用于對照。
3.3.2 酵母雙雜交庫篩選
含有誘餌的 RFY206 與含有獨體庫的 EGY48 雜交，并選出含有獨體和誘餌的細胞。酵母雜交的應用，使得可以有效地篩選多個庫 [13] 。
( 1 ) 在 30°C，10 ml YC Glc his - ura- 培養基中，生長 16 h 駐有 pSH18-34 和 LexA-誘餌質粒的 RFY206。
( 2 ) 用 1.0 OD600= 2.0 X 107 個細胞/ml 換算，通過 OD600 測定細胞濃度。108 個誘餌細胞放在微離心管中以 10000 r/min 的轉速在微離心機上離心 30 s，使細胞旋轉沉降，用 200 μl 培養基讓細胞懸浮。
( 3 ) 加入 107 個駐有獨體的 EGY48 細胞到誘餌細胞中（見 3.1.7 )，并在 YP 平板上鋪開。讓細胞雜交 16 h。
( 4 ) 用 5 ml ( 每次用 1 ml) YPD 培養基將細胞從平板上沖洗下來。100 倍稀釋后測量 OD600，將 108 個細胞鋪在 5 個 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 培養基平板上。于 30°C 保育這些平板 3~4 d。
( 5 ) 復制菌落到 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 培養基平板和 YC Gal leu- his- trp - ura-培養基平板上。保育 16~24 h。真的正克隆將只會在 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 平板上生長。
( 6 ) 在通風廚內，打開平板蓋，加入足夠氯仿以覆蓋板表面。5 min 后將氯仿倒入廢物罐，并讓剩余的氯仿揮發 10 min [ 20 ]。
( 7 ) 在微波爐內加熱瓊脂糖 -磷酸鹽溶液（每皿 10 ml ) ，以溶解瓊脂糖，在水浴中冷卻到 50°C。在試管中加入 35 μl 50 mg/ml X-gal 溶液和 10 ml 瓊脂糖-磷酸鹽溶液，攪拌，并倒入平板中。30°C 保育。觀察顏色。挑出呈現藍色的克隆以備進一步檢驗。
3.3.3 分離獨體的特異性檢測
( 1 ) 于 30°C，在 1.5 ml YPD 培養基中，培養從庫中篩選出來的感興趣的酵母細胞 16 h，并用 Y- DER 酵母 DNA 抽提試劑盒（Pierce) 從酵母細胞中制備 DNA。
( 2 ) 將透析后的酵母 DNA 用電穿孔注入大腸桿菌 KC8 細胞（見 3.1.4)，并在 LB-Ap 平板上挑選轉化細胞。
( 3 ) 在基本 trp-Km 平板上復制菌落，并于 37°C 保育。選取兩個菌落分別接種于 2 ml LB-Ap 培養基中，于 37°C，培養 10 h，并用標準方法抽提質粒 DNA。生長超過 10 h 的 KC8 細胞常產生不純的質粒。用標準的 DNA 測序法測定獨體片段的序列（見注 7 )。
( 4 ) 用 B42-獨體質粒轉化 EGY48，并用相互作用雜交法測定其與各種誘餌的相互作用（見 3.3.1)。
3.3.4 液相 β-半乳糖苷酶測試
生化測量之前，誘館與獨體的親和力可用液相 β-半乳糖苷酶測試半定量地加以確定。這個方法比 3.3.2 小節描述的平板測試更為定量。我們改進了這個方法使之適用于 96 孔平板格式（見注 8 )。
( 1 ) 用 pSH18-34、LexA- 誘餌質粒（pEG202 的衍生物）和 B42 獨體質粒 ( pYesTrp2 衍生物）轉化 RFY206 酵母菌株。把一個菌落接種至 2 ml YC Glc his- ura-trp -，于 30°C 搖動過夜。
( 2 ) 稍稍離心以移除培養基，在溫熱的 YC Glc his- ura-trp- 中懸浮直至 OD600 值為 0.2。于 30°C 搖動 6 h。測 定 OD600 值并以每 350 μl 裝入微離心管中。典型地，我們每次測量三遍。
( 3 ) 將 2 X β-半乳糖苷酶測試溶液與 Y-Per ( Pierce) 按 1 : 1 混合作為工作溶液。加 350 μl 工作溶液到每個樣品中。多次翻轉以混合。
( 4 ) 30°C 保育，同時檢查顏色。當呈現黃色時，加 300 μl 0.5 mol/L 碳酸鈉入離心管，并徹底混合。以最大速度離心微離心管 1 min。測定上清液的 OD420 值。
3.4 獨體的克隆、表達、純化和生物素化
當從庫中篩選出具有所期望特性的獨體后，其基因轉染至大腸桿菌表達載體，獨體則被表達純化為一分離的蛋白質。我們在典型情況下每升培養液得到 10~15 mg 獨體。我們也描述了為在免疫化學應用中便于探測而使獨體生物素化的操作步驟。
3.4.1 獨體的克隆
用寡核苷酸 NdeMetThrFNF(5'-CGGGATCCCATATGCAGGTTTCTGATGTTCCGACCGACCTGGAAGTTGTTGCTG-3'；它包含 Arg6 到 Thr 的突變）和 FNGKKGKR ( 5’-CCG ACTCGAGTTACTATTTACCTTTTTTACCGGTACGGTAGTTAATCGAG-3'），擴增感興趣的獨體基因，然后用 Nde I 和 Xho I 降解并克隆到用同樣的酶降解過的 pET15b (Novagen) 中。通過測序確認表達載體中基因。
3.4.2 獨體的表達
此操作步驟適合于 100 ml 培養液，對初步鑒定而言，這樣的量應該能產生足夠的獨體。
( 1 ) 用獨體表達載體轉化 BL21 ( DE3 ) 細胞（Novagen) ( 見注 9) 。
( 2 ) 接種轉化細胞至 10 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在強烈搖動下，于 30°C 保育 10~16 h。
( 3 ) 接種 2 ml 預培養液至預熱的 100 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在強烈搖動下于 37°C 保育。當 OD600 值達到 0.7 時，加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/L。
( 4 ) 在強烈搖動下于 37°C 保育 3 h 多，并離心收集細胞。細胞可存儲于 -20°C，直至使用。
3.4.3 獨體的純化
此操作步驟適合于 100 ml 培養液（見 3.4.2 )。
( 1 ) 懸浮細胞沉淀于 6.4 ml pH 8.0 的 50 mmol/L Tris-氯化氫中。
( 2 ) 加入 64 μl 50 mg/ml 溶菌酶和 128 μl 50 mmol/L PMSF。混合并于 37°C 保育 15 min。超聲破碎并懸浮直至不再有高度黏滯性。
( 3 ) 加入 910 μl 40 mol/L 氯化鈉。于 4°C 以 27000 g ( 15000 r/min，SS34 轉子）離心 10 min。收集上清液。
( 4 ) 將蛋白質溶液放入裝載了 0.1 mol/L 氯化鎳并用緩沖液 B 平衡過的 Hi-Trap 螯合柱中 （ 1 ml；Amersham-Pharmacia Biotech) 。先用 6 ml 緩沖液 B， 再用 6 ml 含 60 mmol/L 咪唑的緩沖液 B 洗柱。
( 5 ) 用 6 ml 緩沖液 C 洗脫獨體。收集 0.5~1 ml 每份的洗脫液到微離心管中。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析洗脫液。
3.4.4 獨體的生物素化
我們連接生物素到 Lys 的氨基。這雖然不是位點特異的，但在 C 端的擴展部分成團的 Lys 應該是最易發生的修飾位點。這個方法可用來連接其他的片段，如熒光染料。
( 1 ) 完成 3.4 3 小節中純化操作的步驟（1 )~( 4 )。
( 2 ) 用 10 ml 緩沖液 D 清洗柱子。
( 3 ) 溶解 1 mg D-生物素- ε - 氨基己酸輕基琥拍酰亞胺脂（BoehringerMannheim) 于 50 μl 二甲基亞砜，并將其稀釋至 3 ml 緩沖液 D 中。注射 1 ml 溶液到柱中并于室溫黑暗中保溫 1 h。再重復反應 2 次。
( 4 ) 用 6 ml 緩沖液 B 洗柱，并按 3.4.3 節第（ 5 ) 步所述洗脫獨體。