材料與試劑
1、瓊脂粉
2、平皿
3、打孔器
4、生理鹽水或其他緩沖液，可加1/萬的硫柳汞或疊氮鈉防腐。
操作方法
1、稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.8%～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min。
2、將融化的瓊脂倒入平皿內，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。
3、根據要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔。現在一般多打成梅花形孔圖。
4、挑出孔內瓊脂，注意不要挑破孔緣。
5、在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。
6、以毛細滴管吸取樣品加入孔內，注意不要產生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應程度，加多了，易溢出，也影響反應結果。
7、加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h。