一、分析方法分類
（一）終點法
被測物質在反應過程中完全被轉變為產物，即達到反應終點，根據終點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法（end essay）。實際上被測物并沒有完全被轉變，而只是與產物達到一個動態的化學平衡，因此該法稱為平衡法更為恰當。從時間-吸光度曲線來看，到達反應終點或平衡點時，吸光度將不再變化。分析儀通常在反應終點附近連續選擇兩個吸光度值，求出其平均值計算結果，并可根據兩點的吸光度差來判斷反應是否到達反應終點。終點法參數設置簡單，反應時間一般較長，精密度較好。
終點時間的確定：①根據時間-吸光度曲線來確定，如Trinder反應測定尿酸，反應曲線上3～5min時其吸光度已趨向穩定，因而可將5min作為反應終點。②根據被測物反應終點，結合干擾物的反應情況來確定，如在血清白蛋白的溴甲酚綠法測定中，白蛋白與溴甲酚綠在10s內很快完成反應，之后α球蛋白和β球蛋白與溴甲酚綠發生 "慢反應"，使反應曲線上吸光度在10s后仍繼續緩慢上升，持續約達10min，因此終點時間應采用10～30s，而不應選擇10min。
1．一點終點法 在反應到達終點，即在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，這種方法稱為一點終點法（one point end essay），其反應曲線見圖7-3。其檢測結果的計算公式是：待測物濃度CU=（待測吸光度AU－試劑空白吸光度AB）×K。 K為校準系數，詳見第五節二操作方法。
2．兩點終點法 在被測物反應或指示反應尚未開始時，選擇第一個吸光度，在反應到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，此兩點吸光度之差用于計算結果，稱為兩點終點法（two point end essay），其反應曲線見圖7-4。計算公式為CU=（待測吸光度A2－待測吸光度A1）×K。該法能有效地消除溶血（hemolysis）、黃疸（icterus）和脂濁（lipo-turbid）等樣品本身光吸收（見圖7-5）造成的干擾。在單試劑分析加入試劑的初期、或雙試劑分析中第二試劑加入之初，若指示反應吸光度尚未明顯變化，則可在此時選擇第一個吸光度，在指示反應終點時選擇第二個吸光度，從而設置成兩點終點法。但指示反應初期吸光度無明顯變化的化學反應較少，如單試劑方式測定總蛋白、白蛋白、鈣、磷、鎂等的終點法分析項目，及雙試劑方式測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等的終點法分析項目，因反應初期吸光度已有明顯變化，因而均難以用上述方式設置兩點終點法。但在雙試劑分析中，如果將第一吸光度選擇在第二試劑加入前，此時指示反應一般尚未開始，則能容易設置兩點終點法。在此要注意必須將兩次讀吸光度時不同比色液體積進行校正。目前全自動分析儀均具有此自動校正功能，不必手工進行校正。
（二）固定時間法
指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非反應初始吸光度亦非終點吸光度，這兩點的吸光度差值用于結果計算，稱為固定時間法（fixed-time essay），反應曲線見圖7-6。其計算公式與兩點終點法相同，為CU=(A2-A1)×K。有時也稱此法為兩點法。
該分析方法有助于解決某些反應的非特異性問題。例如：苦味酸法測定肌酐，反應的最初30s內，血清中快反應干擾物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能與堿性苦味酸反應；在第二個30s時堿性苦味酸主要與肌酐反應，且此段時間－吸光度曲線的線性較好（故也可用連續監測法測定肌酐）；在80～120s及其以后，堿性苦味可與蛋白質以及其它慢反應干擾物反應。這樣選用反應的第二個30s為測定時間，既避免了快反應物質的干擾，也避免了慢反應物質的影響，使肌酐濃度與吸光度變化呈良好的線性關系，有利于提高分析的特異性和準確度。
（三）連續監測法
連續監測法（continuous monitoring essay）又稱速率法（rate essay），是在測定酶活性或用酶法測定代謝產物時，連續選取時間-吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（ΔA/min）計算結果，見圖7-7A和B。所謂線性期就是各點吸光度差值相等，如圖7-7C所示，圖中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1點至A4點屬線性段。此線性期對底物來說屬零級反應，期間的ΔA/min即為酶促反應的初速度，其大小與被測酶活性成正比。連續監測法的優點即是可以確定線性期并計算ΔA/min，根據此值再準確地計算酶活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優于手工法。連續監測法也可用于測定呈線性反應的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理論（或校準）K值，代謝物濃度CU=ΔA/min×校準K值。關于理論K值和校準K值敘述如下：
1．理論K值 多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認的校準品可用，因而根據酶活性的國際單位定義得出酶活性的計算公式為：酶活性 (U/L)=ΔA/min× ，將此式中 以K來表示，此K值可通過對已知值即指示物質的毫摩爾消光系數（ε）、反應液總容量（TV）、樣品容量（SV）和比色杯光徑（d）計算后得出，即為理論K值，可作為分析參數輸入到分析儀中。
采用理論K值的前提應當是樣品和試劑的加量準確、比色杯光徑準確、溫度控制精確以及波長準確等。但事實上由于各型分析儀在注射器容積步進電機精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測的偏差。溫度的影響有時也非常大，由于反應盤是半暴露的，因此隨著較冷試劑的加入，反應盤中的溫度會逐漸降低，盡管開始測定時反應盤溫度已升到37°C，但在某一項目測定過程的開始階段，溫度可能達不到37°C ，甚至僅35°C左右，且反應過程中仍有可能上下波動，這對于酶學反應來說影響是很大的。如采用37°C時的理論K值，將會使測定結果降低，溫度的波動還會使得結果的重復性降低。當然，若試劑在加入反應杯前經試劑臂內加熱裝置預溫，則基本不影響反應盤溫度。
由于摩爾吸光系數受比色杯光徑、波長、帶寬以及加樣系統的準確性等的影響，書本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數可能與實際所用分析儀所測的不同，因而有必要獲得實際的摩爾吸光系數，然后用來計算的K值稱為實測K值。
（1）NADH（NADPH）摩爾吸光系數的測定：NADH（NADPH）沒有標準純制品，而且配成溶液后穩定性又較差，不能直接用NADH 或NADPH標準液來校正儀器，須通過有NAD+(NADP+)參與的反應途徑。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測定葡萄糖時，葡萄糖的消耗與NADH的生成呈等摩爾關系。葡萄糖有標準純制品，又有國家批準文號的葡葡糖標準液。因此，根據公式A=εbC，已知比色杯光徑b和葡萄糖標準液濃度，測得葡萄糖標準管的吸光度A后便可計算出NADH（NADPH）的摩爾吸光系數ε為 A/bC。假設，葡萄糖標準液濃度為1Ommo1/L(0.01mol/L)，標準液加入量為3.5μL，酶試劑加入量為335μL，比色杯光徑為0.7cm，在340nm測得吸光度為0.465，則
實測NADH摩爾吸光系數= ＝6424 ，即在此臺分析儀上340nm波長處測得NADH（NADPH）的摩爾吸光系數為6424，而理論上NADH（NADPH）的ε為6220。
（2）"色素原"酶促產物在405nm波長摩爾吸光系數的測定：有許多酶底物為人工合成的"色素原"底物，其本身無色，經酶作用后釋放出有色的反應產物，在405nm波長具有吸收峰。最常用色素原底物及其產物為: ALP測定以磷酸對硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)為底物，經酶作用后釋放出黃色的對硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT測定以γ-L-谷氨酰對硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羥基-對硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)為底物，經酶作用后釋放出黃色的對硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或對硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。對硝基苯酚的摩爾吸光系數為18700(405nm)，對硝基苯胺的摩爾吸光系數為9870(405nm)，對硝基-5-氨基苯甲酸的摩爾吸光系數為9490(405nm)。下面是對硝基苯酚的摩爾吸光系數測定方法。
試劑：① 4-NP標準儲存液(1Ommo1/L)。② 4-NP標準應用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP緩沖液稀釋而成)。③ 底物緩沖液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL緩沖液中，37℃,pH l0.09土0.02)。
測定方法：4-NP標準液加入量為5μL，底物緩沖液加入量為350μL，波長405nm，光徑0.7cm，溫度37℃，測定得吸光度為A1；另用蒸餾水代替4-NP標準液，按上述方法測定其吸光度為A2，4-NP標準液吸光度ΔA=
A1- A2，若測得ΔA為0.460，則
實測4-NP摩爾吸光系數＝ ＝18662
2．校準K值 酶活性校準品經校準操作后由分析儀自動計算得出。在進行酶學測定時，如果分析條件的變化如溫度、樣品試劑加量和吸光度檢測偏差可同等程度地影響校準物和待測樣品，則使用校準品能進行補償。一般來說以使用校準K值為好，但必須有兩個先決條件：①必須使用配套的試劑；②必須使用配套的高質量的校準品，該校準品應具有溯源性。使用與該分析儀配套的酶活性校準品也可得到較好的酶活性測定結果。關于酶活性標準品，歐洲標準局（BCR）和美國國家標準技術研究院（NIST）均發表了人血清基質的酶活性標準物，但目前尚無公認的標準（校準）品問世。
（四）透射比濁法
抗原與相應的抗體結合形成的免疫復合物，在反應液中具有一定的濁度，可由一般分光光度法進行透射比濁（transmission turbidimetry）測定，可用于某些蛋白質和藥物濃度等的測定。該法須做多點校準，再經非線性回歸，求出抗原或抗體的含量。使用散射比濁法（scatter turbidimetry）能更加準確快速地檢測抗原抗體形成濁度的大小或其速度，目前專用的特定蛋白分析儀可做此法檢測。有關免疫比濁法原理詳見第二章。
二、常用生化檢測項目分析方法舉例
1．終點法檢測 常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。以上項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。
2．固定時間法 苦味酸法測定肌酐采用此法。
3．連續監測法 對于酶活性測定一般應選用連續監測法，如丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ谷氨氨酰基轉移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯法測定尿素等，也可用連續監測法。
4．透射比濁法 透射比濁法可用于測定產生濁度反應的項目，多數屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質如前白蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白等均可用此法。