在重組蛋白表達中，特別是當在細菌中表達真核蛋白時，主要的瓶頸在于蛋白質的正確折疊與可溶性。一些可溶性蛋白已被作為標簽用來改善目標蛋白質的折疊。這些標簽應該與其他方法共同使用來促進蛋白質的折疊，如誘導后降低培養溫度或者共表達伴侶蛋白（BaneyxandMujacic,2004;deMarcoetal.,2007;Sahdevetal.，2008)，為了獲得較高可溶性的目標蛋白質，有必要嘗試多種可溶性標簽 (PelegandUnger,2008)。對于那些特別難溶的蛋白質來說，可以嘗試在變性的條件下純化蛋白質，然后再進行重折疊 (CabritaandBottomley，2004;JungbauerandKaar，2007;Qoronflehetal.，2007; 詳見第 17 章)。
因為 MBP 標簽能夠特異性地結合麥芽糖 (maltose) 和直鏈淀粉 (atnylose)，所以它不僅可作為一種可溶性標簽 (diGmmetal,,1988)，而且能夠有效地用于親和純化。MBP 是一個 43kDa 的大腸桿菌分泌型蛋白，它的表達水平很高并且能夠提高融合在其 C 端的蛋白質的可溶性 (KapustandWaugh,1999)。近期的研究顯示，融合在目標蛋白質 C 端的 MBP 也同樣有效（Dysonetal.，2004)。MBP 很大，這給細胞的代謝帶來很大負擔，但一個高通量的測試顯示，MBP 標簽是最好的可溶性標簽之一（DysonetaU2004;Kataevaetal.，2005)。但是, 大約有 1/4 的 MBP 融合蛋白依然是不溶的，或者在去除了 MBP 標簽后蛋白質變得易于聚集^例如，我們使用大腸桿菌表達人降鈣素基因相關肽受體組分蛋白（humancalcitoningene-relatedpeptide-receptorcomponentprotein,CGRP-RCP) 時發現，通過腸激酶酶切去除 N 端的 MBP 標簽后出現了目標蛋白質的聚集，雖然該蛋白質已經得到了成功的表達和純化 (Tolunetal.，2007)。每種可溶性標簽的促溶效果是不同的，對于那些難溶蛋白質來說，需要嘗試多種標簽。硫氧還蛋白標簽對于 CGRP-RCP 的表達是無效的，目標蛋白質仍然不溶。Nallamsetty 和 Waugh(2006) 認為，可溶性標簽 (如 MBP 或 NusA) 在目標蛋白質的折疊中提供了幫助，去除標簽后那些易聚集的目標蛋白質的可溶性由該蛋白質的自身性質決定，而不是所用的標簽。
含有 MBP 標簽的商業化載體具有多種標簽去除位點 (NewEnglandBiolabs 公司），可以用于在胞質和周質中表達目標蛋白質。交聯直鏈淀粉 (cross-linkedamylose) 樹脂可以用來結合具有 MBP 標簽的蛋白質，結合的融合蛋白能夠很容易地被含有 10 mm01/1-麥芽糖的洗脫緩沖液洗脫下來。這使得具有 MBP 標簽的蛋白質可以在溫和的環境中經過簡單的一步得到純化。然而，淀粉親和純化法不能夠在有還原劑或者變性環境中進行。
淀粉樹脂會在一定程度上被粗提物中的淀粉酶降解，尤其是生長在豐富 LB 培養基的細胞的提取物，通過在培養基中加人葡萄糖 (〇.2%), 這種作用可以被降到最低。淀粉樹脂可被再生并重復使用多次。
硫氧還蛋白（thi 〇 red 〇 xin，TrX) 是一種熱穩定的、12kDa 大小的大腸桿菌胞內蛋白，該蛋白質很容易過表達，而且即使過表達至細胞總蛋白質的 40% 以上也仍然是可溶的 (LaVallieetal.，1993)，因此在重組蛋白制備中可以將其用做可溶性標簽來避免包涵體的形成（LaVallieetaL,2000)。Dyson 等（2004) 的實驗結果顯示，Trx 標簽加在目標蛋白質的 N 端可以發揮更好的作用。
硫氧還蛋白會積聚在細胞質膜的黏附位點上（BayeretaL,W87)，這使得 Tnc 融合蛋白能夠經簡單的滲透壓或凍融處理釋放出來，這提供了一種簡單的初步純化。通常會在 Tnc 標簽外再添加另外的親和標簽，如組氨酸標簽，以進行進一步的純化。
N 利用物質 A 轉錄抗終止因子（iV-utilizingsubstanceAtranscriptionantiterminationfactor，NusA) 是一個具有 495 個氨基酸殘基的大蛋白質，根據一個可溶性統計模型 (statisticalsolubilitymodel)，與外源蛋白融合表達時，NusA 是大腸桿菌蛋白中可溶性最好的，這是選擇其作為可溶性標簽的原因（Davisetal.，1999;DeMarcoetaL，2004)。
在一些高通量的篩選測試中，NusA 作為可溶標簽與 MBP 效果相似甚至好于 MBP 標簽。
但是，對不同蛋白質來說會有不同的結果。NusA 標簽通常與其他親和標簽一起使用，如組氨酸標簽。
目前，已經研發了一些比較小的溶解性增強標簽（solubilityenhancementtag，SET) 或者溶解性增強肽 (solubilityenhancementpeptide，SEP) 標簽，這些標簽利用高度酸性序列來增強某些目標蛋白質的可溶性 (KatoetaL，2007;ZhangetaL，2004)。其他的一些小標簽有 GBl 標簽 (56 個氨基酸殘基），該標簽基于鏈球菌蛋白 G(streptococcalproteinG) 的 IgG 結合 BI 結構域 (ChengandPatel，2004;Zhouetal.，2001) 還有蛋白 A 的 IgG 結合結構域 (ZZ 結構域，116 個氨基酸殘基；InouyeandSahara，2009;Rondahletal.，1992)。這些比較小的標簽對制備用于核磁共振（NMR) 研究的蛋白質樣品尤其有用 (KatoetaL，20 〇 7)。另夕卜，在使用蛋白質連接法 (proteinligationmethod) 創建 NMR 不可見的可溶性標簽方面也取得了一些進展（Durstetal.，2008;Kobashigawaetal.，2009) 〇研究顯示，融合在目標蛋白質 N 端較小的泛素樣修飾物 (smallubiquitin-likemodifi?er，SUMO) 蛋白 (大約 11kDa) 能夠極大地提高目標蛋白質的穩定性和可溶性（Marblestoneetal.，2006)。在目標蛋白質純化完成后，可用識別 SUMO 結構的 SUMO 蛋白酶 (Ulpl 的催化結構域）去除該標簽（Leeetal.，2008;Panavasetal.,2009)。SUMO 融合系統也已經通過改造用于昆蟲細胞和其他真核表達系統（Liuetal.,2008)。
Halo 標簽是最近構建的模塊化標簽系統（modulartaggingsystem), 該系統具有一個大小為 34kDa 的、經過改造的鹵代燒脫鹵素酶 (haloalkanedehalogenase) 蛋白，它可以結合多種合成的配基（HaloTag 配基；Promega 公司）。這些配基的成分包括一個與 Halo 標簽共價結合的恒定的反應性接頭和一個可變的報告末端，該末端能夠賦予融合蛋白許多有用的性質。因此，單一的標簽可以用于活細胞的亞細胞結構成像、細胞標記和分類、親和純化及固相支持物上的固定（Losetal.，2008)。Ohana 等（20 〇 9) 使用了一個此類標簽（HaloTag7) 與附著在瓊脂糖微球上的氯燒烴接頭（chloroalkanelinker) 進行了親和純化。因為 Halo 標簽能夠以一種高度特異的不可逆的方式與接頭共價結合, 所以即使極低表達量的蛋白質也能夠高效地結合在氯烷烴樹脂上。可以使用煙草蝕紋病毒蛋白酶 (tobaccoetchvirusprotease,TEV) 將目標蛋白質洗脫下來，該酶可以切割位于 Halo 標簽和靶蛋白之間的切割位點。令人驚訝的是，使用一組在大腸桿菌中難以表達的重組蛋白進行的測試表明，這種緊湊的單體 Halo 標簽可以顯著地提高融合蛋白的可溶性 (OhanaetaL，2009)。在這些實驗中，Halo 標簽的表現要大大好于 MBP，確實顯示出了可溶性標簽的功能。
由于蛋白標簽可能會干擾目標蛋白質的正常功能，所以在完成其促進溶解或親和純化的作用后，標簽的去除對于生物學和功能研究很有幫助，對 GST 或 MBP 這樣的大標簽尤其如此，盡管有一些例子顯示融合了標簽的蛋白質更易結晶 (Smythetal.，2003)。
大多數用來向目標蛋白質添加標簽的商業化表達載體也引入了具有特殊序列的切割位點，使用重組的蛋白內切酶可以去除標簽。融合蛋白的親和純化完成后，可以使用蛋白內切酶來處理樣品以切掉標簽，再過一遍親和柱后標簽與重組蛋白會被分開，收集流穿液就會得到目標蛋白質。重組蛋白內切酶通常也會帶有親和標簽，這樣就可以在酶切反應完成后將其輕松去除。
表 16.3 列出了一些常用的蛋白內切酶。因為腸激酶和因子 Xa 在識別位點的 C 端進行切割，這樣就可以將標簽和識別位點序列完整去除，因此它們對去除 N 端的標簽非常有用。但是，這兩種酶有時特異性不是很強, 會在位于其他堿性殘基處的次級切割位點進行切割。凝血酶 (thrombin) 是另一個用于去除標簽的蛋白酶，它也具有相似的次級切割位點（JennyetaL，2003;LiewetaL，2005)。用凝血酶這樣的蛋白酶去除標簽，尤其是對于大規模的蛋白質制備, 與其他高特異性的酶相比，它的好處在于價格低廉且效率更高。
PreScission 蛋白酶是一種具有更長的、更嚴謹識別序列的特異性更高的蛋白酶。它由來自于人鼻病毒-14(humanrhinovirus-14) 的蛋白酶 3C(3Cpro) 和 GS 丁標簽組成，GST 標簽的存在使得該酶對于移除 GST 標簽非常有用。另外一種非常特異且受歡迎的蛋白酶是煙草蝕紋病毒蛋白酶（Kapustetal.,2001), 該酶切割位點后的第一個氨基酸傾向于甘氨酸 (表 16.3), 但也能夠容忍其他氨基酸殘基，只是切割活性會有少許下降。這使得該酶很多時候都能夠將 N 端標簽完整去除，在目標蛋白質上不會留下任何多余的殘基 (KapustetaL，2002)。可以很容易地自己制備大量的煙草蝕紋病毒蛋白酶，通常該酶會帶有一個組氨酸標簽以易于純化及在切割反應完成后將其除去（Tropeaetal.,2009)。
商業公司出售很多類型的煙草蝕紋病毒蛋白酶，它們有的帶有別的親和標簽，有的具有更高的活性及穩定性。
煙草蝕紋病毒蛋白酶的一個變種是煙草脈絡斑點病毒蛋白酶，其具有不同的識別序列 (Nallamsettyetal.,2004)，能夠切開位于兩個不同標簽之間的切割位點（圖 16.1C)。
外切蛋白酶也可以用來去除 N 端標簽，如 TAGzyme 系統 (Arnauetal.，2006a，可從 Qiagen 公司購買）。這個方法使用/二肽氨基肽酶 I(dipeptideaminopeptidaseI,DAPase) 來逐步消化 N 端的標簽直至一個二肽的終止點。已經設計出了多種類似的系統用于處理不同的序列（Arnauetal.，2006b;2008)。
完整去除 C 端的標簽是比較困難的，因為大多數蛋白內切酶只在識別序列的 C 端進行切割。如果有必要完全去除標簽，可以設計更加特異的酶切位點，這些位點的識別是以結構為基礎的 (如 SUM? 蛋白酶;Malakhovetal.,2004)。或者利用自催化蛋白自剪接兀件（autocatalyticproteinself-splicingelement)(Inteins;SalehandPerler，2006)。這兩種切割系統都加上了親和純化標簽—SUM? 融合系統（Buttetal.,2005;Leeetal.,2008): 包括蛋白質內含子-幾丁質結合結構域 (chitin-bindingdomain，CBD; 由 NewEnglandBiolabs 公司將其作為商品化的 IMPACT 系統;Chongetal.，1997) 或蛋白質內含子-聚經基丁酸醋結合蛋白（polyhydroxybutyratebinding) 和類似的蛋白質純化系統 (Gilliesetal…?2008)。
在一些情況下，標簽也可以用化學方法去除。盡管化學切割方法所用試劑價格低廉并且非常有效，但是這些反應需要劇烈的溶劑及導致變性的條件, 所以通常只用于小肽的制備。溴化氰 (CNBr) 可切割甲硫氨酸，當融合蛋白能夠被設計成只有一個甲硫氨酸且位于標簽和目標肽段之間，可以使用這種試劑 (D6belietal.,1998;FairlieetaL,2002)。另外一種化學切割試劑，羥胺（hydroxylamine)，能夠切割天冬酰胺與甘氨酸之間的肽鍵 (Huetal.,2008) 〇實際應用中需要考慮的問題: 盡管在標簽和目標蛋白質之間設計特異性的切割位點相對比較簡單，然而標簽的有效切割并不會總是發生且也難以預測。對于每一個表達構建體都要用實驗檢測切割效率。當使用特異性不強的酶時，還要檢測可能發生在次級切割位點的切割。通常酶的用量和孵育時間需要摸索以使其最優化。切割效率的最大化對于寡聚蛋白質尤其重要，為了目標蛋白質的高產量，必須去除每一個單體上的標簽 (Kenigetal.,2006)。需要切割的序列也需要在空間上能夠讓蛋白酶接觸得到，并且相對地沒有形成復雜結構; 在識別序列和目標蛋白質之間引入數個殘基的間隔序列或接頭序列，或者將不可能形成二級結構的序列放置在切割位點附近, 有時這都可以克服切割效率低下的問題。對于沒有親和標簽的蛋白酶來說，柱上切割 (將蛋白酶注入結合有融合蛋白的親和柱）比批式反應 (batchreaction) 更加有效。
很多種蛋白質標簽都可以用于促進重組蛋白的表達和純化。但是，即使有如此龐大的標簽庫, 結構基因組學的蛋白質制備機構得到可溶性純蛋白質的成功率也低于 50%(StructuralGenomicsConsortiumetal.,2008)。盡管這些大規模的研究項目設計出/許多很好的策略, 考慮到蛋白質折疊的多樣性及它們之間不同的生物化學性質，并沒有一套通用的可溶性或者親和標簽適用于所有蛋白質。標簽的選擇在很大程度上還是依賴于需要表達的蛋白質以及制備蛋白質的目的。在此，我們已經評述了大部分的有效的蛋白質表達標簽以及與它們使用相關的問題。