甲基橙在分析化學中是一種常用的酸堿滴定指示劑，不適用于作有機酸類化合物滴定的指示劑。其濃度為0.1%的水溶液pH為3.1（紅）～4.4（黃），適用于強酸與強堿、弱堿間的滴定。它還用于分光光度測定氯、溴和溴離子，并用于生物染色等。
甲基橙曾在實驗室和工農業生產中用作化學反應的酸堿度控制，以及化工產品和中間體的酸堿滴定分析。甲基橙指示劑的缺點是黃紅色澤較難辨認，已被廣泛指示劑所代替。甲基橙也是一種偶氮染料，可用于印染紡織品。
