病原菌的分離鑒定及其疫苗的制備（1）

一、實驗目的
熟悉水產細菌性病原的分離、培養、純化與鑒定的基本方法，了解所分離細菌性病原的形態特征及培養特點，了解細菌性滅活疫苗制備的基本過程。
二、實驗材料
患白內障病虎紋蛙（或其他患細菌性疾病的水產動物）、健康虎紋蛙、腦膜炎敗血黃桿菌（虎紋蛙白內障病的病原）
三、實驗藥品、用具
2216E 瓊脂平板、 2216E 瓊脂斜面、福爾馬林、無菌蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩沖液、接種環、解剖刀、剪刀、鑷子、滴管、紗布、白瓷盤、酒精棉球、滅菌試管、 96 孔板、注射器、酒精燈、離心機（包括離心管）、水族箱、記號筆、
四、實驗操作程序
（一）病原菌的分離與鑒定
1 ．培養基的制備
（ 1 ）普通肉湯培養基：
按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胨及牛肉膏），置于鋁鍋或搪瓷缸中。
牛肉膏 5g 磷酸氫二鉀 1g
蛋白胨 10g 蒸餾水 1000ml
氯化鈉 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6
初配好的培養基呈酸性故要用 NaOH 調整。將 pH 測定后的肉湯培養基用濾紙過濾，將過濾好的肉湯分裝試管、鹽水瓶、三角燒瓶等容器，待滅菌。
（ 2 ）普通營養瓊脂培養基
普通肉湯 1000ml
瓊脂 20g
瓊脂是由海藻中提取得一種多糖類物質，對病原性細菌無營養作用，但在水中加溫可融化，冷卻后可凝固。在液體培養基中加入瓊脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培養基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％則成半固體培養基。
將稱好的瓊脂加到普容肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將 pH 調至 7 . 4 ～ 7 . 6 。瓊脂融化過程中需不斷攪拌，并控制火力，不使培養基溢出或燒焦，并注意補充蒸發掉的水份。

加熱溶解好的培養基可用濾紙進行過濾，固體培養基要用 4 層紗布趁熱過濾（切勿使培養基凝固在紗布上），之后按實驗要求，將配制好的培養基分裝入試管或三角瓶中，包扎好待滅菌，將培養基置于高壓蒸汽鍋內， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通瓊脂斜面，也可直立，凝固后即成高層瓊脂。
鹽水瓶中的普通瓊脂以手掌感觸，若將瓶緊握手中覺得燙手，但仍能握持者，此即為傾倒平皿的合適溫度（ 50 ～ 60 ℃ ），每只滅菌培養皿倒入約 15 ～ 20ml ，將皿蓋蓋上，并將培養皿于桌面上輕輕回轉，使培養基平鋪于皿底，即成普通瓊脂平板。
培養基中的某種成分，如血清、糖類、尿素、氨基酸等在高溫下易于分解、變性，故應過濾除菌，再按規定的量加入培養基中。