痘苗病毒系統基因表達實驗

實驗方法原理 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質粒載體開始，然后用重組質粒通過脂質體介導轉染已經被vTF7-3（可以持續表達T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的細胞。收獲后，基因產物在細胞內的表達可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法分析鑒定。

實驗材料 脂質體懸液vTF7-3 痘苗病毒儲液生長至匯片的 CV-1 細胞重組質粒

試劑、試劑盒 低血清 Opti-MEMI 培養基完全 DMEM-10 培養基

儀器、耗材 6 孔組織培養板杯狀超聲儀聚苯乙烯管

實驗步驟

1. 用 CsCl/溴化乙錠離心或 PEG 沉淀純化重組質粒，每孔細胞需要 5 μg DNA 進行轉染。

如果使用 pTM1 質粒（圖 16.16.2）, 必須保證目的基因起始 ATG 位于 pTM1 的 NcoI 位點。可以通過限制酶作圖或 DNA 測序鑒定構建是否正確。

2. 在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培養基將 5×105 CV-1 細胞/孔加入 6 孔組織培養板培養。直至細胞幾乎匯片生長（一般過夜）。用血球計數器對細胞進行計數。

3. 將 vTF7-3 儲液渦旋混勻以打散團狀物。按照下面的步驟用杯狀超聲儀進行超聲：

3.1 在杯中裝入冰水（大約 50％ 的冰）；

3.2 將裝有 vTF7-3 儲液的小管放在冰水上；

3.3 以最大功率超聲 30 s，儲液置冰水上 >30 s，再繼續超聲。

4. 用 Opti-MEMI 將病毒稀釋至 2×107 pfu/ml。

5. 用 0.5 ml/孔的稀釋病毒儲液（10 pfu/細胞）感染步驟 2 制備的 CV-1 細胞。溫育 30 min，每 5～10 min 晃動一次。

6. 在感染結束前 5 min 制備脂質體懸液。加入 1 ml 的 Opti-MEMI 至 12 mm× 75 mm 聚苯乙烯管中（每孔制備一管），渦旋脂質體懸液，加 15 μl 至培養基中，渦旋混勻。加入 5 μg 的重組質粒（來自步驟 1），輕輕混合均勻。

脂質體在儲存期間會沉淀，因此在使用前，應將其渦旋混勻。不要使用聚丙烯管，因為 DNA/脂質體混合物會吸附在其表面。

7. 吸出 CV-1 細胞的病毒接種物，直接加入 DNA/脂質體混合物。培養 5～24 h，表達的蛋白質可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法鑒定。

注意事項

1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。

2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。

其他

重組質粒：將目的基因亞克隆到 pTF7-5 或 pTM1 載體或其他含有 T7 啟動子的質粒。